Особенности метаболизма триптофана и его влияние на поведение и физиологические параметры мышей, гетерозиготных по гену трн2

Алиментарно-зависимые заболевания, проявляющиеся ожирением и являющиеся следствием развития метаболического синдрома, бесспорно занимают в структуре заболеваний многих стран мира существенную долю, затрагивая значительную часть населения и являясь одной из основных причин снижения качества жизни [1-3]. За последнее десятилетие все больше исследований направлено на изучение ожирения и метаболических сбоев на клеточном уровне [4]. Психоэмоциональная нестабильность, наблюдаемая при депрессивных и тревожных эпизодах, опосредованно влияет на проявление многих заболеваний, одним из которых является метаболический синдром. Однако, природа коморбидности данных заболеваний до сих пор вызывает много вопросов.

Серотонинергическая система образует диффузную сеть в центральной нервной системе и играет важную роль в регуляции настроения и познания. Манипулирование уровнями триптофана, путем истощения или добавления, является экспериментальной процедурой изменения периферических и центральных уровней серотонина [1].

Триптофан — незаменимая аминокислота, содержащаяся во многих белковых продуктах и диетических белках [5]. Помимо своей роли в образовании белка, триптофан является предшественником ряда метаболитов, прежде всего кинуренина и нейротрансмиттера серотонина [6].

Синтез серотонина происходит на периферии в нейронах кишечника и энтерохромаффинных клетках и центрально в нейронах шва в стволе головного мозга. Для центральной выработки серотонина триптофану сначала необходимо получить доступ к центральной нервной системе (ЦНС) через гематоэнцефалический барьер [1]. Триптофан является субстратом для большой нейтральной системы переносчика аминокислот и конкурирует за транспорт с несколькими другими аминокислотами, необходимыми для функционирования мозга. Эта конкуренция за транспорт является основой для некоторых диет с острым истощением триптофана.

Общепризнано, что большая часть нашего триптофана связана с альбумином плазмы и, следовательно, недоступна для транспортировки в мозг. Это обычно ограничивает триптофан, доступный для центрального синтеза серотонина, но высвобождение триптофана из этого пула может увеличить транспорт. В дополнение к уровням свободного триптофана, результаты исследований физических упражнений показывают, что должны существовать другие, в настоящее время неизвестные, механизмы, контролирующие центральное поглощение триптофана [7-9] Ген TPH2 кодирует изофермент триптофангидроксилазы, который обнаруживается в серотонинергических нейронах головного мозга и является ферментом, ограничивающим скорость синтеза серотонина (5гидрокситриптамина или 5HTT) [10].

Для изучения уровня 5-HT в мозге был разработан ряд моделей животных с мутациями в генах, участвующих в передаче 5-HT и формировании серотонинергических нейронов. Одной из высокоточных моделей являются мыши-нокауты триптофан гидроксилазы-2 (TPH2), которая кодирует одноименный фермент и отвечает за скорость синтеза 5-HT из триптофана с использованием кислорода и тетрагидробиоптерина (BH4) в качестве субстратов и железа в качестве кофактора [11]. Фермент TPH2 экспрессируется нейронами в ядре шва головного мозга и играет роль в когнитивной деятельности и проявлении обсессивно-компульсивного расстройства [12].
Целью данного исследования являлась оценка воздействия длительного введения триптофана на метаболические и поведенческие показатели мышей, гетерозиготных по гену TPH2.
Эксперимент проведен на базе ФГБНУ «Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН в Экспериментальной клинике-лаборатории биологически активных веществ животного происхождения.
Исследование проводилось на 51 клинически здоровых мышах линии C57BL/6J TPH2, полученных из SPF-вивария биоцентра (Вюрцбург, Германия), самках дикого типа (WT) и гетерозиготного генотипа (Het), и самцах дикого типа (WT) и гетерозиготного генотипа (Het), n=25 (m=27,6±0,5 г), возрастом 12-14 мес, в течение 68 суток. 

Животные прошли период адаптации на протяжении 3 суток и содержались в системе индивидуально-вентилируемых клеток (Tecniplast, Италия), создающей оптимальный микроклимат сходные в каждой отдельной клетке (температура ((22±3)°С), влажность ((5060)%), освещение 12/12.

Животные всех групп потребляли полнорационный комбикорм 3 г/голову (Ssniff, Германия) и воду для поения, полученную на установке водоподготовки EMD MilliporeRiOs™ 50 (MercMillipore, Германия), минерализовали путем добавления минеральных солей (314–382 мг/л: гидрокарбонаты – 144-180, сульфаты – <1, хлориды – 60-76, кальций – 6, магний – 3, натрий – 50-58, калий – 50-58). Самки содержались в группах по 5-6 особей, самцы в группах по 2-3 особи.
Мыши были распределены на 8 групп (n=6) перед началом эксперимента по полу, генотипу, вводимым веществам (дистилированная вода (ДВ) или триптофан (Trp)): 1 группа – самки WT + ДВ; 2 группа - самки WT + Trp; 3 группа - самки Het + ДВ; 4 группа - самки Het + Trp; 5 группа - самцы Wt + ДВ; 6 группа - самцы Wt + Trp; 7 группа - самцы Het + ДВ; 8 группа - самцы Het + Trp.
Введение дистилированной воды (0,2 мл/гол) и триптофана (400 мг/кг) осуществляли ежедневно. 

Взвешивание животных осуществляли с использованием электронных лабораторных весов (Ohaus, США) раз в 2 суток. Учет рациона (взвешивание потребляемых воды и комбикорма) производили в одно и то же время с использованием электронных лабораторных весов (Ohaus, США) раз в 2 суток. 

Анализ относительного содержания мышечной и жировой тканей с применением ЯМРрелаксометра проводили на 0, 21, 35, 49 и 65 сутки исследования с использованием прибора
Ядерно-магнитного резонансного релаксометра Minispec MQ LF110 (Bruker, Германия). Животных предварительно адаптировали к установке и фиксации в рестрейнере в течение 3-х суток. Прибор был откалиброван с растительного масла и куриной грудки по протоколу, предложенному в мануале прибора. Перед тестированием проводилась проверка контроля качества внутренних напряжений, температуры, магнитов и параметров ЯМР с использованием стандарта, предоставленного производителем. Животных помещали в красный пластиковый фиксатор (диаметром 50 мм) и удерживали в неподвижном состоянии путем введения в цилиндр плотно прилегающего поршня. Затем фиксатор опускали в камеру для образцов прибора примерно на 2 минуты – продолжительность сканирования.

На 0, 66-67 сутки эксперимента проводилось поведенческое тестирование: «Открытое поле» и «Экстраполяционная задача побега». Для определения уровня тревожно-подобных состояний у мышей использовали тест-установку «Открытое поле», включающую квадратную арену с высоким бортом, изготовленную из материала, не впитывающего запахи, и имеющая два раздвижных борта со скрепляющими механизмами. Время экспозиции – 3 минуты. Тест «Экстраполяционная задача побега» проводили с целью выявления когнитивных функций мышей. Экспериментальная установка представляет собой цилиндрическую емкость (диаметр 35см, высота 40 см), наполненную водой, с опущенной в воду лестницей. Мыши помещались в воду и фиксировалось время, в течение которого они выбирались по ней из цилиндра.

Процесс исследования поведения был записан на видеокамеру Nikon D5600 18-55 VR kit (Nikon, Таиланд), обработка видеозаписей осуществлялась с помощью программного обеспечения ToxTrac (Umea, Sweden) и RealTimer (OpenScience, Россия).

Все проводимые манипуляции с животными осуществлялись соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. 
Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ Statistica 10.0. и Microsoft Excel.

Количественные признаки распределялись по критериям Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова, равенство дисперсий – с использованием критерия Левена. Для определения достоверности различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенства дисперсий, применяли Дисперсионный анализ (ANOVA). Для сравнения количественных признаков, не удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, использовали непараметрический аналог для независимых выборок – U-критерий Манна-Уитни. Для проверки различий между двумя выборками парных или независимых измерений по уровню количественного признака применяли критерий Уилкоксона. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05. Для описания признаков с нормальным распределением использовали среднее с указанием стандартного отклонения (М±SD), для признаков отличным от нормального распределения указывали медиану (ME) с межквартильным интервалом ([P25P75]), также данные представлены в min-max (минимальное и максимальное значение измеряемой величины), в долях (процентах) или в абсолютных числах.

Скорость роста, определяемая как прирост веса в единицу времени, уменьшилась у мышей, потреблявших триптофан, при этом наиболее выраженно у животных группы 8 (p=0,028). У гетерозиготных самок 4 группы скорость роста уменьшилась незначительно. У мышей, потреблявших дистиллированную воду, групп 1 (p=0,046) и 5 (p=0,116), скорость роста практически не изменилась за период исследования, в то время как показатели животных 7 группы имели тенденцию снижения за период исследования (p=0,249). Стоит отметить, что скорость роста достоверно отличалась между показателями мышей 1 и 2 групп – 90,9% (p=0,073) и между показателями групп 7 и 8 – 83,4 % (p=0,002). 
Относительно 0 суток у мышей 1 группы на 21 сутки содержание жира увеличилось на 21,5 %, на 35 сутки –  26 %, на 49 сутки – 29,9 %, на 65 сутки – 22,5 %. У 2 группы на 21 сутки содержание жира уменьшилось на 15,86 %, на 35 сутки – 15,75 %, на 49 сутки – 10,22 %, на 65 сутки – 18,3 % относительно контрольного измерения на 0 сутки. Результаты между контрольной группой и исследуемой группой на 65 сутки отличались на 40,8 %. У мышей 3 группы на 21 сутки содержание жира увеличилось на 18,16 %, на 35 сутки – 16,5 %, на 49 сутки – 11,4 %, на 65 сутки – 34,52 %. У 4 группы на 21 сутки содержание жира увеличилось на 34,6 %, на 35 сутки – 36,2 %, на 49 сутки – 18,6 %, на 65 сутки – 6,3 %. Стоит отметить, что у 4 группы процентное содержание жира в организме мышей с 0 по 35 сутки увеличилось, однако, на 49 сутки результаты ЯМР показали уменьшение содержания жира в организме. В итоге результаты между контрольной и исследуемой группами на 65 сутки составили разницу в 28,2 %. Относительно 0 суток у мышей 5 группы на 21 сутки содержание жира уменьшилось на 11, 6 %, на 35 сутки – 12,3 %, на 49 сутки – 10,0 %, на 65 сутки – 7,0 %. У 6 группы на 21 сутки содержание жира уменьшилось на 0,56 %, на 35 сутки – 1,2 %, на 49 сутки – 3,8 %, на 65 сутки – 9,2 %. У контрольной и у испытуемой групп наблюдалось уменьшение процентного содержания жира в организме. Таким образом 5 группа является единственной контрольной группой, у которой отмечено уменьшение содержания жира по сравнению с 0 сутками на протяжении всего эксперимента. На 65 сутки разница между 5 и 6 группами составила 2,2 %.
У мышей 7 группы на 21 сутки содержание жира увеличилось на 27,87 %, на 35 сутки – 35, 47 %, на 49 сутки – 35,9 %, на 65 сутки – 31,7 %.  У 8 группы на 21 сутки содержание жира уменьшилось на 29,04 %, на 35 сутки – 27,26 %, на 49 сутки – 27,0 %, на 65 сутки – 38,71 %.

Разница между контрольной (7 группой) и исследуемой (8 группой) составила 69,8 %. 

Относительно 0 суток процентное содержание мышц у мышей 1 группы на 21 сутки уменьшилось на 8,3 %, на 35 сутки – 11,5 %, на 49 сутки – 11,09 %, на 65 сутки – 9,14 %. У 2 группы на 21 сутки процентное содержание мышц увеличилось на 7 %, на 35 сутки – 9,3 %, на 49 сутки – на 4,5 %, на 65 сутки – на 8,0 %. Разница на 65 сутки между группами 1 и2 составила 17,14 %. У мышей 3 группы на 21 сутки наблюдалось уменьшение на 6,7 %, на 35 сутки – 5,4 %, на 49 сутки – 4,2 %, на 65 сутки – 12,0 %. У мышей 4 группы на 21 сутки процентное содержание мышц уменьшилось на 8,5 %, на 35 сутки – 9,4 %, на 49 сутки – 6,2  %, на 65 сутки – 1,6. Стоит отметить, что у мышей 4 группы с 0 по 35 сутки наблюдалось уменьшение процентного содержания мышц, однако к 65 суткам показатели увеличились, и разница с 3 группой составила 10,4 %. У мышей 5 группы на 21 сутки процентное содержание мышц увеличилось на 4,05 %, на 35 сутки – на 4,1 %, на 49 сутки – уменьшилось на 6,0 %, на 65 сутки – увеличилось на 3,06 %, относительно измерения на 0 сутки. У 6 группы на 21 сутки уменьшилось на 1,2 %, на 35 сутки увеличилось на 0,9 %, однако, на 49 сутки разница составила 1,1 %, на 65 сутки – на 5,05 % относительно измерения на 0 сутки. Разница между группами 5 и 6 на 65 сутки составила 2,0 %. У мышей 7 группы на 21 сутки процентное содержание мышц в организме уменьшилось на 8 %, на 35 сутки – на 9,9 %, на 49 сутки – на 10,58 %, на 65 сутки – на 9,19 %. У мышей 8 группы на 21 сутки наблюдалось увеличение процентного содержания мышц на 10,2 %, на 35 сутки – на 10,43 %, на 49 сутки – на 8,5 %, на 65 сутки – на 12,35 %. Итоговая разница между 7 и 8 группой составила 21,5 %. 

Таким образом, за период исследования наблюдалась общая тенденция снижения процента жировой ткани и повышения процента мышечной массы у групп мышей, которым вводили триптофан, и увеличение процента жировой ткани и снижения мышечной ткани у групп мышей с внутрижелудочным введением дистиллированной воды. 

В поведенческом тесте «Экстраполяционная задача побега» у мышей всех групп на 67 сутки общее время, затрачиваемое на выполнение задачи, значительно сократилось по сравнению с 0 сутками: у мышей 1 группы на 31,1 % (p=0,683), у 2 группы на 71,5 % (p=0,220), у 3 группы на 42,2 % (p=0,450), у 4 группы на 79,2 % (p=0,023), у 5 группы на 47,5 % (p=0,220), у 6 группы на 73,0 % (p=0,130), у 7 группы на 54,1 % (p=0,220), у 8 группы на 66,7 % (p=0,041). В целом анализ данного тестирования определил, что при потреблении триптофана у обоих полов на 67 сутки время выполнения задачи уменьшилось на более высокий процент, по сравнению с животными контрольных групп. 
В поведенческом тесте «Открытое поле» среднее общее пройденное расстояние у 1 группы на 67 сутки уменьшилось на 48,7 % (p=0,115) по сравнению с 0 сутками, у 2 группы – на 25,5 % (p=0,600), у 3 группы – на 64,7 % (p=0,176), у 4 группы – на 55,7 % (p=0,028), у 5 группы – на 14,0 % (p=0,753), у 6 группы увеличилось на 6,4 % (p=0,916), у 7 группы уменьшилось на 29,0 % (p=0,075), у 8 группы – на 55,2 % (p=0,028). 

На 67 сутки разница времени замирания мышей 1 группы относительно 3 группы стало меньше на 292,6 %, время замирания мышей 2 и 4 группы сравнялось – разница составила 5,5 %, у мышей 5 группы время замирания относительно 7 группы стало больше на 83,3 %, у мышей 6 группы относительно 8 группы – больше на 19,7 % соответственно. Снижение пройденного расстояния говорит о снижении тревожности мышей, в группах 3 и 4 эффект был более выражен. У мышей всех групп на 67 сутки наблюдалось снижение двигательной активности, за исключением мышей групп 5 и 6. Более высокую двигательную активность показали самки, в том числе потреблявшие триптофан. Показатель замирания в тесте был снижен между контрольными точками у мышей 1, 2, 5, 6 групп. Также отмечено, что у животных группы 3 наблюдалось увеличение данного показателя.

Таким образом, оценка коэффициентов роста и прироста животных показала уменьшение показателей в группах самцов обоих генотипов (дикий тип и гетерозиготы), которым вводился внутрижелудочно триптофан, а также в группе 2 (самки дикого типа, с внутрижелудочным введением триптофана). Метаболические изменения, обнаруженные у мышей методом ЯМР-релаксометрии показали, что у гетерозиготных самок и самцов после продолжительного введения триптофана наблюдалось снижение процента жировой ткани и повышение процента белковой ткани в организме.

Результаты поведенческого теста «Экстраполяционная задача побега» показали, что триптофан положительно влияет на когнитивные способности: мыши, потреблявшие триптофан, справлялись с задачей быстрее, чем потреблявшие дистиллированную воду. Также на 67 сутки у мышей всех групп снизилась двигательная активность в тесте «Открытое поле», за исключением гетерозиготных самцов, в то время как самки показали более высокую амбуляционную активность. Уменьшение пройденного животными расстояния на 67 сутки говорит о снижении тревожности.

Для полноценной оценки влияния триптофана, требуется дальнейший более подробный анализ полученных нами результатов и определение корреляционных зависимостей, а также результатами других экспериментальных данных. Исследование выполнено в рамках темы НИР № FNEN-2019-0008 государственного задания ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем имени В.М. Горбатова» РАН.
 
Литература

1. Москалева, П. В. Ассоциация полиморфизма генов TPH1 и TPH2 с риском развития психоневрологических расстройств / П. В. Москалева, Н. А. Шнайдер, Д. В. Дмитренко // Успехи физиологических наук. – 202 – Т. 52. – № 2. – С. 51-60.
2. Яузина, Н. А. Современные экспериментальные модели депрессии / Н. А. Яузина, Ю.

К. Комлева, А. Б. Салмина, М. М. Петрова, Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская, Г. Е. Герцог // Биомедицина. – 2013. – №1. – С. 61-77.

3. Polozova, E. I. Relationship between immunological alterations, hypoxia and inflammation in arterial hypertension combined with metabolic syndrome / E. I. Polozova, E. V. Puzanova, A. A.

Seskina // Medical Immunology (Russia). – 2020. – Vol. 22. – No 5. – P. 1003-1008.

4. The treatment of metabolic syndrome in patients with morbid obesity / O. V. Galimov, V. O. Khanov, T. R. Ibragimov // Medical News of North Caucasus. – 2022. – Vol. 17. – No 2. – P. 121126.
5. Pourhamzeh, M. The Roles of Serotonin in Neuropsychiatric Disorders / M. Pourhamzeh, M. Arabi, S. Mehrabi // Cellular and Molecular Neurobiology. – 2021. –  42(6). – Р. 1671–1692.
6. Strekalova, T. Understanding how stress responses and stress-related behaviors have evolved in zebrafish and mammals / T. Strekalova, M. S. de Abreu, K. A. Demin, A. Giacomini// Neurobiology of stress. – 2021. – Vol. 15. – P. 100405.
7. Bamalan, O. A. Serotonin / O. A. Bamalan, Y. Khalili // Physiology. – 2019. – Vol. 18. – p. 38-45.
8. Waider, J. Tryptophan hydroxylase-2 (TPH2) in disorders of cognitive control and emotion regulation: A perspective / J. Waider, N. Araragi, L. Gutknecht, K. P. Lesch // Psychoneuroendocrinology. – 2011. – Vol. 36. – No 3. – P. 393-405.
9. Emerging, K. Roles for Serotonin in Regulating Metabolism: New Implications for an Ancient Molecule / K. Emerging, J. M. Yabut, A. E. Green, G. R. Steinberg // Endocrine Reviews. – 201 – Vol. 40. – No 4. – P. 1092-1107.
10. Simon, G.E. Association between obesity and psychiatric disorders in the us adult population/ G.E. Simon, M. Von Korff, K. Saunders, D.L. Miglioretti, P.K. Crane, G. Van Belle, R.C. Kessler // Arch. Gen. Psychiatry. – 2006. – Vol.63. – P.824–830.
11. Gromnatska, N. M. Peculiarities of Lipid Metabolism in Children with Metabolic Syndrome / N. M. Gromnatska, S. K. Tkachenko // Children health. – 2014. – No 5(56). – P. 15-20.
12. Vilara, M. T.  Distribution of 5-HT receptors in the central nervous system: an update // Handbook of the Behavioral Neurobiology of Serotonin. – 2020. –Vol. 31. – P. 121–146.

---