Биосинтез пищевых микроингредиентов при культивировании стрессоустойчивых штаммов стрептомицетов на гидролизатах крахмалов

Аннотация. Гидролизаты крахмала представляют интерес в качестве сырья для получения ряда микроингредиентов, востребованных в различных пищевых технологиях. При культивировании на гидролизатах крахмала штаммы Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 адаптируются к пониженным температурам с сохранением биосинтетической активности.
Abstract. Starch hydrolysates are of interest as raw materials for a number of micro-ingredients in demand in various food technologies. When cultivated on hydrolysates of starch strains of Streptomyces lucensis PMBC Ac-1743 and Streptomyces violaceus PMBC Ac-1734 adapt to low temperatures with preservation of biosynthetic activity.

Гидролизаты крахмала представляют интерес в качестве сырья для получения ряда микроингредиентов, востребованных в различных пищевых технологиях. Среди них значительную долю занимают продукты микробиологического синтеза. Первичные метаболиты, в частности ферменты амилолитического действия, являются биокатализаторами гидролиза углеводов [1]. Ингибиторы их активности – вторичные метаболиты – перспективны в качестве субстанции для создания пищевых продуктов диабетического направления [2].

Нарушение обменных процессов в человеческом организме, связанное c углеводами, часто приводит к сахарному диабету, нежелательным симптомам в переваривании пищи (мальдигестия) и всасывании пищевых веществ в кишечнике (мальабсорбция), панкреатиту, язве и многим другим пищеварительным заболеваниям. При таких недугах назначают, в частности, заместительную терапию комбинацией ферментов с амилолитической активностью или, наоборот, комбинацией биологически активных веществ с ингибиторной активностью по отношению к амилазам.

С использованием крахмалсодержащего сырья во ВНИИПД разработаны технологии ингибиторов амилаз для создания пищевой продукции в перспективе со статусом «функциональная» [3].
Цель данной работы заключается в исследовании способности штаммов Streptomyces к синтезу ингибитора амилаз при культивировании на гидролизатах крахмала после длительного воздействия на клетки продуцентов низких температур (от –12 ^оС до –150 ^оС).

Объектом исследования являлись селекционированные в институте штаммы Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 – продуценты ингибитора гликозидаз [4, 5]. Штаммы Streptomyces хранились при температурах –12ºС, –18ºС, –80^оС и –150^оС в 15%-ном растворе глицерина. Для сравнения штаммы хранили при температуре +4^оС (без глицерина).

Глубинное культивирование Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus проводили на гидролизате кукурузного крахмала периодическим способом в условиях шейкера-инкубатора Multitron (INFORS, Швейцария) в колбах вместимостью 750 см³ со скоростью перемешивания (160 ± 20) оборотов в минуту при температуре плюс (29 ± 1) °С в течение 120 ч [4, 5].

Состав среды для ферментации, г/дм³: гидролизат крахмала с декстрозным эквивалентом ДЕ = (25 ± 5) % – 20,0; соевая мука – 5,0; натрий хлористый – 3,0; калий фосфорнокислый двузамещенный – 1,0; магний сернокислый семиводный – 0,5; рН 7,0 [4, 5]. Для гидролиза крахмала использовали ферментный препарат Амилосубтилин Г3х (ГОСТ 23635-90).

Ингибиторную активность, ед ИА/см³ определяли в инактивированных нативных растворах колориметрическим методом по отношению к панкреатической амилазе (тест-фермент, «Sigma», США) [6]. Инактивацию собственной амилазы продуцентов проводили нагреванием растворов до плюс (98 ± 1) °С. Обработку экспериментальных данных проводили с привлечением методов математической статистики и программ Excel XP.

Результаты исследований показали, что при культивировании исследуемых штаммов стрептомицетов на гидролизатах различных крахмалов синтезируется ингибитор амилаз, причем более активный в отношении амилазы животного происхождения (Таблица 1).

Таблица 1
Ингибиторная активность при ферментации гидролизатов крахмала (120 ч)

Наименование штамма	Наименование углевода	Ингибиторная активность, ед ИА/см³, в отношении
Наименование штамма	Наименование углевода	α-амилазы из панкреаса свиньи	α-амилазы Bacillus subtilis
Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743	Крахмал кукурузный	1400 ± 50	400 ± 15
Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743	Крахмал картофельный	1350 ± 50	240 ± 20
Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734	Крахмал кукурузный	1500 ± 20	350 ± 30
Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734	Крахмал картофельный	1620 ± 90	130 ± 10

В результате изучения биосинтетической активности штаммов после длительного низкотемпературного воздействия установлено, что ингибиторная активность сохранялась на более высоком уровне при пониженных температурах хранения, чем при положительной температуре (+4 ºС) (Рисунок). Одним из объяснений этого результата является то, что в присутствии криопротектора − глицерина концентрация электролитов после достижения равновесного состояния со льдом при любой температуре понижается и биохимические процессы в клетках микроорганизмов во время замораживания не претерпевают изменений. Другое объяснение: при более резком перепаде температур с отрицательных на положительные (до +37 °С при оттаивании) интенсифицируется восстановление биохимических реакций в ответ на стрессовое воздействие. Аналогичный эффект получен при изучении амилолитической, протеиназной и глюкозооксидазной активностей после хранения штаммов при температурах −12 °С и −18 °С.

Ферментативные активности после низкотемпературного хранения в результате последующего культивирования штаммов были выше в 1,3 раза, чем при +4 °С (Таблица 2).

Таблица 2
Ферментативные активности в не инактивированных нативных растворах
в конце процесса (120 ч)

Ферментативная активность, ед/см³	ВКПМ Ac-1743			ВКПМ Ac-1734
Ферментативная активность, ед/см³	+4 ºС	–12 ºС	–18 ºС	+4 ºС	–12 ºС	–18 ºС
Амилолитическая	0,34 ± 0,01	0,42 ± 0,01	0,43 ± 0,01	0,38 ± 0,01	0,43 ± 0,01	0,45 ± 0,01
Протеиназная	0,204 ± 0,011	0,265 ± 0,015	0,065 ± 0,002	0,144 ± 0,015	0,187 ± 0,015	0,184 ± 0,008
Глюкозооксидазная	0,081 ± 0,008	0,104 ± 0,011	0,105 ± 0,011	0,111 ± 0,081	0,143 ± 0,018	0,145 ± 0,012

В процессе ферментации протеиназная и глюкозооксидазная активности возрастали и достигали максимального значения в конце биотехнологического процесса. Возможно, штаммы стрептомицетов синтезируют протеиназы для регулирования количества собственной амилазы, конкурирующей с ингибитором в условиях лимитирования процесса по источнику углерода. Повышение глюкозооксидазной активности по-видимому, обусловлено интенсификацией окислительно-восстановительных процессов в клетках стрептомицетов.

При оценке ингибиторной активности в не инактивированном нативном растворе наблюдалось увеличение амилолитической активности, обусловленное совместным воздействием собственной амилазы продуцента и панкреатической амилазы, используемой в качестве тест-фермента. В результате ингибиторная активность обнаруживалась только при многократном разбавлении нативного раствора, в результате которого распадался комплекс ингибитор – амилаза.

На основании полученных закономерностей сделан вывод о том, что исследуемые штаммы стрептомицетов являются стрессоустойчивыми и адаптируются к пониженным температурам с сохранением биосинтетической активности при культивировании на гидролизатах крахмала. Продуктивность по амилолитическим ферментам и ингибиторам амилаз увеличивается по сравнению с результатами хранения при положительной температуре. Гидролизаты кукурузного крахмала более предпочтительны в качестве сырья для получения амилаз, синтезируемых стрептомицетами. Продуцируемые ими ингибиторы панкреатической амилазы, являющиеся субстанцией для создания пищевых ингредиентов функционального назначения, обладают повышенной активностью и представляют также интерес в качестве регуляторов активности гидролитических ферментов при биокаталитической обработке крахмалсодержащего сырья.

Литература

1.Шарова, Н.Ю. Разработка научных основ новых технологий пищевых добавок и ингредиентов с использованием крахмалсодержащего сырья: автореф. дис. … докт. техн. наук: защищена 13.11.2013 / Н.Ю. Шарова. – Санкт-Петербург: НИУ ИТМО, 2013. – 32 с.
2. Принцева А.А. Исследование инвертазной активности при изменении
параметров процесса ферментации сахарозоминеральной среды и гидролизата крахмала микромицетом aspergillus niger / А.А. Принцева, Н.Ю. Шарова, Т.В. Выборнова // Пищевые системы. – 2018. – Т. 1. – № 1. – С. 19-23.
3. Roberfroid, M.B. Global view on functional foods: European perspectives // M.B. Roberfroid / British J. Nutrition. – 2002. – Vol. 88. – № 2. – P. 133–138.
4. Ходкевич, О.А. Разработка технологии биосинтеза ингибитора α-гликозидаз актиномицетами рода Streptomyces и применение комплексной добавки на его основе в хлебопечении: дис. … канд. техн. наук. – Санкт-Петербург, СПбГУНиПТ, 2009. – 135 с.
5. Штамм актиномицета Streptomyces lucensis – продуцент ингибитора гликозидаз: пат. 2355755 Рос. Федерация: МПК C12N 1/20, C12N 9/24, C12N 9/26, C12R 1/465 / Шарова Н.Ю., Позднякова Т.А., Ходкевич О.А.; заявитель и патентообладатель Государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПАКК) (RU). – № 2008101164/13; заявл. 09.01.2008; опубл. 20.05.2009, Бюл. № 14.
6. Штамм актиномицета Streptomyces violaceus – продуцент ингибитора гликозидаз: пат. 2346042 Рос. Федерация: МПК C12N 9/24, C12N 9/26, C12N 1/20, C12R 1/465 / Шарова Н.Ю., Никифорова Т.А., Позднякова Т.А.; заявитель и патентообладатель Государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПАКК) (RU). – № 2006138251/13; заявл. 30.10.2006; опубл. 10.02.2009, Бюл. № 4.
7. Шарова, Н.Ю. Свойства конидий штаммов актиномицетов streptomyces lucensis и streptomyces violaceus в процессе хранения при низких температурах/
Н.Ю. Шарова, Т.В. Выборнова, А.А. Принцева, Б.С. Манжиева // Пищевые системы. – 2018. – Т. 1. – № 3. – С. 27-32.
8. Акулова, Н.Ю. Ингибиторы альфа-глюкозидаз из Streptomyces. Выделение и свойства: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.00.04. – Санкт-Петербург, 1993. – 22 с.: ил.

Шарова Н.Ю.^1,2, д-р техн. наук; Принцева А.А.^1,2; Выборнова Т.В.¹;
Манжиева Б.С.¹

¹Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок – филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН,
г. Санкт-Петербург
²НИУ ИТМО, г. Санкт-Петербург

Чтобы оставить комментарий зарегистрируйтесь или войдите на сайт используя свою учетную запись