Бактериальный матрикс как фактор выживания и распространения Listeria Monocytogenes

Аннотация. Из мясных продуктов и полуфабрикатов были выделены 20 бактерий вида L. monocytogenes, после чего изучена их способность образовывать биопленки (полисахаридных матрикс). В результате комплексного исследования подтверждена биопленкообразующая способность 18 штаммов. Образование биопленок повышает выживаемость бактерий рода Listeria, и приводит к циркуляции штаммов на мясоперерабатывающих предприятиях.
Abstract. There are isolated with meat and meat products twenty bacteria of the species L. monocytogenes, and it was studied their ability to form biofilms (polysaccharide matrix) was studied. The results of the study confirmed the ability to create biofilms in 18 strains. The formation of biofilms increases the survival of bacteria of the genus Listeria, and leads to the circulation of strains in meat processing plants.

Приоритетной задачей исследований в области микробиологии в последние годы называют поиск новых методов ингибирования патогенных микроорганизмов. В феврале 2017 года Всемирная Организация Здравоохранения опубликовала список так называемых «приоритетных патогенов» и призвала направить внимание исследователей на поиск новых альтернативных антимикробных агентов, способных ингибировать микроорганизмы из списка «приоритетных патогенов».

Одним из перспективных подходов к решению этой задачи является более глубокое исследование причин и механизмов устойчивости бактерий к деструктивным воздействиям и антибиотикам.
В последние годы выживаемость микроорганизмов и растущую резистентность к ингибирующим веществам ассоциируют с явлением, так называемого, биопленкообразования. Традиционные подходы к микробиологическим исследованиям базируются на предпосылках о планктонном состоянии микроорганизмов. Однако сейчас все больше исследователей склоняются к мнению, что планктонное состояние бактерий является промежуточной фазой цикла жизни бактериальных сообществ.

Биопленки, также называемые «матрикс», впервые были описаны в середине 1980-х годов.  Механизм образования биопленок в настоящее время изложен во многих источниках, наиболее подробное описание представлено в 2007г. в работе  Д. Монро [3].

Современные исследование в области бактериологии подтверждают, что явление биопленкообразования присуще многим микроорганизмам. Ряд исследователей указывают способность к образованию биопленок как возможную причину проявления устойчивости к ингибирующим факторам, а также в отдельных случаях обуславливают антибиотикорезистентность. [1,2]

В мясной отрасли наибольшую опасность представляют собой бактерии рода Listeria, в частности высокопатогенные штаммы L. monocytogenes. В настоящее время согласно ТР ТС 021/2011 и ТР ТС 034/2013  L. monocytogenes не допускается в 25 г большинства видов продукции и полуфабрикатов. Несмотря на это, данный микроорганизм достаточно часто выявляют в продуктах питания.
Задачей настоящего исследования был мониторинг мясной продукции на наличие биопленкообразующих L. monocytogenes.

Объектами исследования являлись штаммы L. monocytogenes, выделенные из продуктов и полуфабрикатов из мяса и птицы. Для настоящего исследования были отобраны 20 штаммов L. monocytogenes, выделенные из мясной продукции и полуфабрикатов, им присвоены условные номера (табл. 1).

Для исследования биопленкообразования в мире применяются несколько методик, на основе которых мы разработали внутрилабораторный алгоритм исследования биопленкообразующей способности:

1. культивирование микроорганизмов;
2. удаление культуральной жидкости и планктонных клеток, опредеделение количества планктонной культуры в культуральных жидкостях;
3. фиксация и окрашивание биопленок;
4. определение условного количества биопленок.

Таблица 1
Условные номера образцов и наименование продуктов, из которых были выделены L. Monocytogenes
 

Усл. №	Продукт	Усл. №	Продукт
1	Сосиски	11	Бедро
2	Пельмени	12	Бедро
3	Куриное филе	13	Бедро
4	Окорочка куриные	14	Окорочок
5	Сырокопченая колбаса	15	Куриное филе
6	Сырокопченая колбаса	16	Куриное филе
7	Зразы	17	Куриное филе
8	Котлеты	18	Корейка
9	Котлеты	19	Куриный окорочок
10	Куриное филе	20	Котлеты

Поскольку биопленки образуются на поверхностях, биопленкообразование исследовали с использованием тефлоновых кубиков, увеличивающих площадь поверхности. В настоящей работе использовались тефлоновые кубики со стороной 4×4×6 мм (рис.  1). Тефлоновые кубики помещали в пробирки (рис. 2) в таком количестве, чтобы общая площадь кубиков составляла 2016 мм² (21 кубик в каждую пробирку). Для каждого исследуемого штамма L. monocytogenes были подготовлены одна пробирка с тефлоновыми кубиками и одна без них.
 
Пробирки стерилизовали двухступенчатым методом. Вначале в них наливали хромовую смесь «хромпик», выдерживали 2 часа, после чего промывали дистиллированой водой до нейтральной реакции рН. Этот этап необходим для разрушения презумптивных биопленок. Пробирки подвергали паровой стерилизации при температуре 121°С в течение 15 мин, затем разливали в них по 4 мл питательного бульона TSB.

В бульоны засевали культуру L. monocytogenes и инкубировали в течение 48 часов при температуре (36±1)°С. После окончания инкубирования пробирки тщательно перемешивали на лабораторном встряхивателе Vortex, после чего удаляли культуральную жидкость. Для определения количества клеток, выросших на бульоне, измеряли оптическую плотность культуральной жидкости по отношению к бульону без микроорганизмов.

Согласно закону Бугера-Ламберта-Берра и Бредфорда построена калибровочная кривая, позволяющая провести определение количества клеток. Расчетные параметры для проведения определения: грань кюветы 10 мм, используемый светофильтр 600 нм; оптическая плотность стерильного бульона 0,145.

В табл. 2 представлены результаты измерения оптической плотности и рассчитанное количество клеток в культуральных жидкостях.

Наибольшее количество планктонных клеток было отмечено в образце №8, также большое количество планктонных клеток было в образцах №7, 11 и 20.

Пробирки промывали стерильной дистиллированной водой от остаточных планктонных клеток. В промывной воде после каждой промывки замеряли оптическую плотность при 600 нм. Окончанием промывки считали тот момент, когда значения оптической плотности промывной воды приближались к нулю, и не изменялись.

Таблица 2
Оптическая плотность и количество клеток L. monocytogenes в культуральных жидкостях
 

усл. №	оптическая плотность	количество клеток L. monocytogenes	усл. №	оптическая плотность	количество клеток L. monocytogenes
1	0,592	6×106	11	0,623	1×107
2	0,602	8×106	12	0,413	1×104
3	0,461	7×104	13	0,489	9×104
4	0,439	3×104	14	0,462	7,5×104
5	0,543	9×105	15	0,497	2×105
6	0,449	5×104	16	0,525	6×105
7	0,732	7×108	17	0,404	8×103
8	0,827	1×1010	18	0,522	7×105
9	0,577	3×106	19	0,407	8,5×103
10	0,320	7×102	20	0,717	4×108

После этого в пробирки заливали по 4 мл 96%-ного этилового спирта и оставляли на 20-30 мин для фиксации биопленок. Спирт удаляли, в пробирки заливали по 4,5 мл спиртового раствора генцианвиолета для окрашивания зафиксированных на поверхности биопленок. Краситель выдерживали в течение 1 часа, после чего краситель удаляли, и промывали пробирки стерильной дистиллированной водой до тех пор, пока промывная вода станет прозрачной.

Затем в пробирки наливали по 5 мл 96%-го этилового спирта для адсорбции красителя на 30 мин. оптическая плотность полученного элюента показывает условное количество биопленки. Оптическую плотность измеряли при длине волны 490 нм на фотоэлектроколориметре отдельно в пробирках с тефлоновыми кубиками, и отдельно в образцах без тефлоновых кубиков (табл. 3).

Таблица 3
Условное количество биопленок (оптическая плотность элюентов)
 

усл. №	Оптическая плотность		усл. №	Оптическая плотность
	Без кубиков	С кубиками		Без кубиков	С кубиками
1	0,000	0,070	11	0,015	0,079
2	0,008	0,069	12	0,016	0,073
3	0,019	0,070	13	0,015	0,102
4	0,014	0,060	14	0,030	0,118
5	0,018	0,079	15	0,015	0,109
6	0,003	0,070	16	0,034	0,106
7	0,046	0,038	17	0,021	0,103
8	0,018	0,052	18	0,018	0,099
9	0,035	0,073	19	0,009	0,142
10	0,021	0,070	20	0,011	0,089

Как видно, наибольшее количество биопленки образовывали штаммы L. monocytogenes усл. № 19 и 14. В образце усл. №7 значения оптической плотности в пробирке без кубиков были выше, чем в пробирках с кубиками. Вероятно, это связано с особенностью формирования биопленки эти штаммом. Данный алгоритм позволяет оценить условное количество биопленки в зависимости от её площади, но не учитывает толщину образованной биопленки. В случае, когда оптическая плотность ниже в образцах с заведомо большей площадью, мы предполагаем, что штамм образует биопленку иной толщины.

Для подтверждения биопленкообразования проводили этап «рекультивирования». Для этого пробирки после всех измерений промывали стерильной дистиллированной водой от остаточных количеств спирта и красителя, после чего заливали в каждую пробирку по 5 мл питательного бульона TSB. Все пробирки инкубировали при температуре (30±1)°С, каждые 24 часа производили пересев 500 мкл в хромогенный питательный агар ALOA (Biomeriuex) газонным методом. Чашки инкубировали при (37±1)°С в течение 24 часов. При отсутствии роста на чашках, их инкубировали еще 24 часа. В случае появления на чашках характерных колоний L. monocytogenes делали вывод о подтвержденной биопленкообразующей способности штамма.

Через 24 часа инкубирования рост был отмечен на 18 чашках из 20-ти. Оставшиеся чашки термостатированы еще 24 часа, но на них не появилось роста. (табл. 4) Таким образом, в результате эксперимента доказано биопленкообразование исследуемых штаммов L. monocytogenes. При этом максимальное количество колоний было отмечено в образце усл. №16, также очень большое количество колоний Listeria monocytogenes  отмечено в образцах усл. № 12 и 18.

Следует отметить, что при количественном определении бактерий на плотных питательных средах следует принимать в расчет только те чашки, количество колоний на которых составляло от 15 до 300. Однако в настоящей работе учтены и количества колоний менее 15 на чашке в связи с тем, что даже небольшое количество выросших  L. monocytogenes указывают на биопленкообразующую способность штамма.

Таблица 4
Количество клеток L. monocytogenes на этапе «рекультивирования»
 

Усл. №	Кол-во колоний	Усл. №	Кол-во колоний	Усл. №	Кол-во колоний	Усл. №	Кол-во колоний
1	0	6	7	11	1	16	> 300
2	> 300	7	50	12	> 300	17	2
3	0	8	> 300	13	5	18	> 300
4	> 300	9	20	14	> 300	19	1
5	2	10	10	15	3	20	7

Выводы. Проведенные исследования доказывают, что L. monocytogenes образует биопленки, которые способствуют повышению выживаемости. Из 20 исследованных бактерий вида Listeria monocytogenes восемнадцать образовывали биопленки. Факт, что эти бактерии были выделены из мясных продуктов и полуфабрикатов, косвенно указывает на проблематику циркуляции L. monocytogenes на предприятиях переработки мяса и птицы, и, вероятно, причиной их возобновляющейся циркуляции является образование биопленок.
Комплекс проведенных исследований создает предпосылки для дальнейшего изучения биопленкообразования листерий, их устойчивости и подходов к разрушению биопленок.

Литература

1. Юшина, Ю.К. Микробные контаминанты мяса: что нового? / Ю.К. Юшина, Д.С. Батаева, О.В.Соколова // Все о мясе. – 2017. – № 4. – С. 37-39.
2. Батаева, Д.С. Оценка бактериоциногенности индигенных молочнокислых бактерий, полученных с туш крупного рогатого скота / Д.С. Батаева, О.В. Соколова, Е.В. Зайко, В.В. Пашкова // Теория и практика переработки мяса. – 2018. – Т. 3. – № 2. – С. 22-32.
  3. Monroe, D. Looking for chinks in the armor of bacterial biofilms / D. Monroe // PLoS Biology. – 2007. – 5(11). – P.2458-2461.
4. Глушанова, Н.А. Бактериальные биопленки в инфекционной патологии человека / Н.А. Глушанова, А.И. Блинов, Н.Б. Алексеева // Медицина в Кузбассе. – 2015. – С.30-35.
5. Koutsoumanis, K.P. Encyclopedia of Agriculture and Food Systems: Food Safety: Emerging Pathogens / K.P. Koutsoumanis, A. Lianou, J.N. Sofos // Reference Module in Food Science. – 2014. – P. 250-272.
6. Батаева, Д.С. Оценка эффективности норматива listeria monocytogenes /
Д.С. Батаева, Е.В. Зайко // Все о мясе. – 2017. – № 1. – С. 8-10.

Соколова О.В., канд техн. наук; Юшина Ю.К., канд. техн. наук
ФБГНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН, г. Москва
 

---