Верификация способов идентификации аллельных вариантов WX-A1-локуса WAXY-гена пшеницы

Аннотация. Целью исследования являлась верификация способов идентификации аллельных вариантов Wx-A1-локуса Waxy-гена пшеницы. Апробированные способы проведения ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа для идентификации аллельных вариантов Wx-A1-локуса Waxy-гена Triticum aestivum L обеспечили корректную молекулярно-генетическую оценку протестированных образцов пшеницы.
Abstract. The aim of the study was to verify the methods for identifying allelic variants of the Wx-A1 locus of the wheat Waxy-gene. Probated PCR and PCR-RFLP assays for identifying allelic variants of the Triticum aestivum L Wx-A1 locus provided the correct molecular genetic evaluation of the tested wheat samples.

Знания об ассоциации аллельного полиморфизма Waxy-генов пшеницы с мукомольно-хлебопекарными и технологическими свойствами зерна позволяют разрабатывать системы молекулярного маркирования для нужд маркер-ориентированной селекции [6, 7, 1].

Известно влияние сочетания нефункциональных нуль-аллелей Waxy-генов в геномах пшеницы на образование крахмала амилопектинового типа с пониженным содержанием амилозы или полным его отсутствием, что в свою очередь сказывается на технологических свойствах крахмала и муки пшеницы [10, 5, 4].

Среди функциональных аллелей Waxy-генов, кодирующих изоформы гранул-связанной синтазы крахмала (Granule-Bound Starch Synthase, GBSSI), встречаются и редкие аллельные варианты с до конца не изученным их влиянием на содержание амилозы в крахмале пшеницы [9, 2].

Системы молекулярного маркирования на основе ДНК-технологий обеспечивают идентификацию перспективных генотипов пшеницы, расширяя круг доноров и источников хозяйственно-ценных аллелей [3, 8].

Цель исследования – верификация способов идентификации аллельных вариантов Wx-A1-локуса Waxy-гена пшеницы.

Образцы яровой пшеницы, происследованные в настоящей работе, предоставлены селекционерами Татарского научно-исследовательского института сельского хозяйства (г. Казань).
Геномная ДНК из зерновок пшеницы экстрагирована коммерческим набором «ДНК-сорб С».

Процедуры амплификации ДНК и эндонуклеазного расщепления проведены на термоциклере «Терцик» с применением соответствующих пар олигонуклеотидных праймеров и рестриктазы (таблица).

Таблица
Режимы ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа для идентификации аллельных вариантов Wx-A1-локуса Waxy-гена пшеницы
 

Наименование и последовательность олигонуклеотидных праймеров	Режим ПЦР	Режим ПДРФ
Wx-A1L: 5/-CCCCAAAGCAAAGCAGGAAAC-3/ Wx-A1R: 5/-CGGCGTCGGGTCCATAGATC-3/	×1: 94 °C – 4 мин. ×40: 94 °С – 45 сек, 55 °С – 30 сек, 72 °С – 1 мин. ×1: 72 °С – 7 мин.	HindIII 37 °C 3 ч.
Wx-A2L: 5/-CGCAGGGGAAGACGTGGT-3/ Wx-A2R: 5/-CGTTGACGATGCCGGTGATC-3/	×1: 94 °C – 4 мин. ×40: 94 °С – 45 сек, 65 °С – 40 сек, 72 °С – 50 сек. ×1: 72 °С – 7 мин.

При верификации способов проведения ПЦР, ПЦР-ПДРФ и секвенирования ДНК для идентификации аллельных вариантов Wx-A1-локуса Waxy-гена пшеницы осуществляли анализ выравниваний соответствующих нуклеотидных последовательностей,  рестрикционное картирование и расчет ПЦР-ПДРФ-профилей, включая in silico моделирование (рисунок 1).

По результатам апробации протокола ПЦР-ПДРФ с праймерами Wx-A1L и Wx-A1R для идентификации аллельных вариантов Wx-A1-локуса Waxy-гена пшеницы на образцах яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ установлено присутствие в геномах исследованных генотипов Triticum aestivum L. функциональных (A1a / A1g) и нулевого (A1b) аллелей Wx-A1-локуса.


Рисунок 1 – Моделирование ПЦР- и HindIII-ПЦР-ПДРФ-профилей аллельных вариантов Wx-A1-локуса Waxy-гена пшеницы (праймеры Wx-A1L + Wx-A1R)
Обозначения: 1) ПЦР-профиль Wx-A1a-аллеля (671 bp). 2) HindIII-ПЦР-ПДРФ-профиль Wx-A1a-аллеля (495/176 bp). 3) ПЦР-профиль Wx-A1g-аллеля (671 bp). 4) HindIII-ПЦР-ПДРФ-профиль Wx-A1g-аллеля (495/176 bp). 5) ПЦР-профиль Wx-A1b-аллеля (652 bp). 6) HindIII-ПЦР-ПДРФ-профиль Wx-A1b-аллеля (652 bp).

Для эффективной дискриминации функционального аллельного варианта Wx-A1a от Wx-A1g-аллеля нами был апробирован протокол ПЦР с праймерами Wx-A2L и Wx-A2R для идентификации аллельных вариантов Wx-A1-локуса Waxy-гена пшеницы с последующим прямым секвенированием Wx-A1-специфичных продуктов.

Следует отметить, что помимо амплификации Wx-A1-специфичных фрагментов, также наблюдалась наработка характерных для Wx-D1-локуса Waxy-гена ампликонов, сопоставимых с расчетными данными выравнивания соответствующих нуклеотидных последовательностей и моделирования ПЦР-профилей (рисунок 2).

В результате выравнивания секвенированных нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Wx-A1-локуса Waxy-гена генотипов яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ обосновано наличие у 5 линий редко встречаемого аллельного варианта Wx-A1g Waxy-гена Triticum aestivum L.

Апробированные способы проведения ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа для идентификации аллельных вариантов Wx-A1-локуса Waxy-гена пшеницы обеспечили проведение корректной молекулярно-генетической оценки исследованных образцов яровой пшеницы по заявленному гену.

Рисунок 2 – Моделирование ПЦР-профилей аллельных комбинаций
Wx-A1- и Wx-D1-локусов Waxy-генов пшеницы (праймеры Wx-A2L + Wx-A2R)
Обозначения: 1) Wx-A1a/D1a (533/491 bp); 2) Wx-A1b/D1a (533 bp); 3) Wx-A1a/D1b (491 bp); 4) Wx-A1g/D1a (533/491 bp); 5) Wx-A1g/D1b (491 bp).

Литература

1. Абдулина, И.Р. Молекулярная идентификация генотипов яровой пшеницы по аллельным вариантам Waxy-генов / И.Р. Абдулина, Р.Р. Вафин, И.В. Ржанова, А.Л. Гараева, Д.Ф, Асхадуллин, Д.Ф, Асхадуллин, Н.З. Василова, Л.И. Зайнуллин, Ф.К. Алимова  // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 1-1. – С. 13–17.
2. Абдулина, И.Р. Выявление аллельного варианта Wx-A1g Waxy-гена у генотипов яровой пшеницы отечественной селекции / И.Р. Абдулина, Р.Р. Вафин, Л.И. Зайнуллин, Ф.К. Алимова // Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки. – 2012. – Т. 154. – № 4. – С. 158–163.
3. Климушина, М.В. Распределение аллелей генов Wx в коллекции мягкой пшеницы Краснодарского НИИСХ им. ПП Лукьяненко / М.В. Климушина, Н.И. Гладких, М.Г. Дивашук, Л.А. Беспалова, А.В. Васильев, Г.И. Карлов // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2012. – T. 16. – № 1. С. 187– 192.
4. Caramanico, R. Interplay between starch and proteins in waxy wheat / R. Caramanico, A. Barbiroli, M. Marengo, D. Fessas, F. Bonomi, M. Lucisano, M.A. Pagani, S. Iametti, A. Marti // Cereal Science. – 2017. – V. 75. – P. 198–204.
5. Guzmán, C. Wheat waxy proteins: polymorphism, molecular characterization and effects on starch properties / C. Guzmán, J.B. Alvarez // Theor. Appl. Genet. – 2016. – V. 129,  – N. 1. – P. 1–16.
6. McLauchlan, A. Development of robust PCR-based DNA markers for each homeo-allele of granule-bond starch synthase and their application in wheat breeding programs / A. McLauchlan, F.C. Ogbonnaya, B. Hollingsworth, M. Carter, K.R. Gale, R.J. Henry, T.A. Holton, M.K. Morell, L.R. Rampling, P.J. Sharp, M.R. Shariflou, M.G.K. Jones, R. Appels // Australian Journal of Agriculture Research. – 2001. – V. 52. – N. 11-12. – P. 1409–1416.
7. Nakamura, T. Rapid classification of partial waxy wheats using PCR-based markers / T. Nakamura, P. Vrinten, M. Saito, M. Konda // Genome. – 2002. – V. 45. – No. 6. – P. 1150–1156.
8. Vafin, R.R. Identification of Triticum aestivum L. genotype by allelic versions of Waxy-genes and HMW glutenin subunits / R.R. Vafin, I.V. Rzhanova, D.F. Askhadullin, D.F. Askhadullin, N.Z. Vasilova, M.Sh. Tagirov, S.V. Tyulkin, I.R. Abdulina, G.I. Shagalieva // Ecology, Environment and Conservation. – 2015. – V. 21. – N. Suppl. Nov. – P. 137–143.
9. Vanzetti, L.S. Genetic variability for waxy genes in Argentinean bread wheat germplasm / L.S. Vanzetti, L.A. Pfluger, M. Rodriguez-Quijano, J.M. Carrillo, M. Helguera // Electronic Journal of Biotechnology. – 2009. – V. 12. – N. 1. – P. 1-9.
10. Yamamori, M. Differential effects of Wx-A1, -B1 and –D1 protein deficiencies on apparent amylase content and starch pasting properties in common wheat / M. Yamamori, N.T. Quynh // Theor. Appl. Genet. – 2000. – V. 100. – P. 32–38.

Вафин Р.Р., д-р биол. наук
ВНИИПБиВП – филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН, г. Москва
 
 

---