Протеолитические ферментные препараты в биотрансформации продуктов переработки зерновых и бобовых культур

Ферментативная модификация белков растительного сырья, в том числе и белков зерновых и бобовых культур, представляет собой важный этап в перспективных технологиях глубокой переработке растительного сырья. Ферментативный способ модификации растительных белков является предпочтительнее физико-химической модификации, поскольку его преимуществом являются мягкие режимы проведения реакций, возможность регулирования степени гидролиза, определенная направленность и сохранение биологической ценности [1, 4, 7–9]. В результате модификации белковых компонентов зерна и продуктов его переработки с применением ферментных препаратов протеолитического действия могут быть получены продукты гидролиза с определенным профилем пептидов и набором аминокислот, обладающие специфическими свойствами [1, 2, 7, 11].

Установлено, что для применения белковых гидролизатов необязательно получать их с высокой глубиной гидролиза, так как пептиды также хорошо усваиваются организмом [4, 7]. Гидролизаты белков делятся на 2 большие группы: частично гидролизованные белки, полностью гидролизованные белки. Каждый из гидролизатов обладает определенными свойствами, которые обусловливают область их применения. Полностью гидролизованные белки обладают низкой антигенной активностью, что дает возможность использовать их в гипоаллергенных детских диетах.

Такие гидролизаты содержат свободные аминокислоты и короткие пептиды. Частично гидролизованные белки включают в себя широкий спектр продуктов гидролиза. В их состав входят: фракция свободных аминокислот и коротких пептидов; достаточно большое количество олигопептидов; существенное количество высокомолекулярных продуктов гидролиза. Их характеризуют как слабо- и среднегидролизованные белки. Гидролизаты, относящиеся к этой группе, существенно не различаются между собой, их используют в качестве легкоусвояемого источника аминного азота в специализированных диетах [7].

Протеолитические ферментные препараты наряду с амилазами являются лидерами мирового рынка, на их долю приходится 25%. Однако российский рынок остается ненасыщенным, наиболее значимыми предприятиями в области производства ферментных препаратов в России являются ООО «ПО «Сиббиофарм», НПЦ «АгроСистема», ООО «Агрофермент». При этом следует подчеркнуть, что отечественные ферментные препараты пользуются спросом в кормопроизводстве, промышленные предприятия пищевых отраслей отдают предпочтение импортной продукции [10].

Целью исследования являлась оценка эффективности протеолитических ферментных препаратов бактериального и грибного происхождения при действии на различные природные субстраты: тритикалевые и ржаные отруби, соевый шрот, цельносмолотые семена нута.

В качестве ферменных препаратов использовали:

• «Нейтраза MG1,5» (Novozymes, Дания) – бактериальная металлопротеиназа (Zn), продуцируемая Bacillus amyloliquefaciens. Это эндопротеаза, которую рекомендуют использовать в случаях, когда протеинсодержащий комплекс должен быть более или менее экстенсивно разложен до пептидов.
• «Алкалаза FG» (Novozymes, Дания) – бактериальная протеиназа, продуцируемая Bacillus licheniformis. Основной ферментный компонент Субтилизин Калсберга, который является эндопротеазой. В активном центре этого фермента содержится остаток серина. Ингибируется ДПФФ (диизопропилфторфосфат) и ФМСФ (фенилметилсульфанилфторид).
• «Протеаза GC -106» (Döhler, Германия) – грибная протеаза, продуцируемая Aspergillus oryzae.
• «Дистицим Протацид Экстра» (Genencor, США) – грибная протеаза, продуцируемая Aspergillus niger.

Все ферментные препараты рекомендованы для гидролиза биополимеров зернового сырья.

Активность протеаз определяли по накоплению аминного азота в процессе протеолиза методом формольного титрования. Содержание растворимого белка по методу Лоури. Фракционный состав простых белков по Осборну [5].

Молекулярную массу продуктов протеолиза определяли методом гель-хроматографии [6] на колонке с TSK gel Toyopearl HW-55F, гель этой марки позволяет разделять белки с молекулярной массой от 1000 до 700000 Да. Предварительно колонку откалибровали для определения свободного (Vсв.) и общего (Vобщ.) объема колонки. Свободный объем определяли по выходу декстрана синего (молекярная масса около 2 млн Дальтон). Он составил 44 мл. Общий объем – по выходу тирозина. Он составил 140 мл. Для определения молекулярной массы белков графическим методом колонку маркировали стандартными метчиками с известной молекулярной массой фирмы «Merck» (Германия).

На первом этапе работы изучали общее содержание белка и фракционный состав растворимых белков тритикалевых и ржаных отрубей, а также соевого шрота и цельносмолотого нута – как объектов ферментативной биотрансформации под действием микробных ферментных препаратов (табл. 1–3).

Содержание общего белка в тритикалевых и ржаных отрубях закономерно больше, чем его содержание в целом зерне. Следует отметить, что в целом количество белка в отрубях с драных систем превышает содержание белка с размольных систем на 1,5–2,0%.

Для тритикалевых и ржаных отрубей характерно преобладание альбумино-глобулиновой фракции на долю которой приходится в среднем 58,8 %. Следует отметить высокое содержание белка в нерастворимом остатке, как для тритикалевых, так и для ржаных отрубей (около 20 %). Это свидетельствует о том, что ржаные и тритикалевые отруби могут служить дополнительным источником белка.
Аналогичные исследования, проведенные на соевом шроте и цельносолотом нуте показали, что общее содержание белка в соевом шроте составило 38,2 %, в семенах нута – 23,7%
Фракционный состав растворимых белков соевого шрота и семян нута представлен в таблице 3.

Приведенные данные свидетельствуют о высоком содержании глобулиновой фракции, при этом если общее содержание белка в соевом шроте выше, чем в семенах нута, но количество глобулинов наоборот больше в семенах нута – примерно на 5,5%. Содержание белка в нерастворимом остатке находится на достаточно высоком уровне в 13%.

На следующем этапе изучали основные кинетические характеристики реакций протеолиза исследуемых ферментных препаратов при действии на различные природные субстраты. Состав зернового субстрата, который представляет сложную гетерогенную систему, может оказывать влияние на характер протекания процесса протеолиза, и изменять кинетические параметры ферментативной реакции, которые были определены при действии на стандартный субстрат, заявленные фирмами- производителями.

Температурные оптимумы и оптимумы рН действия ферментных препаратов изучали в диапазоне от 20 до 70ºС, рН от 3,0 до 8,5 с использованием 0,1 М цитратно-фосфатного и фосфатного буферов. Для выявления оптимальной дозировки фермента использовали диапазон конечных концентраций в инкубационной смеси от 0,25 до 1,25 ед. ПС/ г отрубей (шрота, зерна). Насыщающую концентрацию субстрата – в диапазоне от 20 до 120 мг/мл.

Проведенные исследования показали, что при действии всех исследуемых ферментных препаратов на тритикалевые и ржаные отруби начальная скорость ферментативной реакции (V0) составила 30 мин. Оптимумы температуры и рН при действии Нейтразы 1,5МG – 50ºС и 5,5; Алкалазы FG – 45ºС и 6,5; Протеазы GC-106 – 50ºС и 5,5–6,0; Дистицим Протацид Экстра – 40ºС и 3,5 соответственно. Оптимальной дозировкой ферментного препарата для Нейтразы 1,5МG и Алкалазы FG – 0,5 ед. ПС/г отрубей; для Протеазы GC-106 и Дистицим Протацид Экстра – 0,75 ед. ПС/г отрубей.
При аналогичных исследованиях, когда в качестве субстрата выступали соевый шрот и цельносмолотые семена нута, начальная скорость ферментативной реакции (V0) также составила 30 мин. Оптимумы температуры и рН для всех ферментных препаратов лежат в диапазоне 40–50ºС и 5,0–6,5 соответстенно, за исключением Дистицим Протацид Экстра, для которого оптимум рН составил 3,5 для обоих субстратов. Оптимальной дозировкой ферментного препарата для Нейтразы 1,5МG и Алкалазы FG – 0,8 ед. ПС/г соевого шрота и 1,0 ед. ПС/г семян нута; для Протеазы GC-106 и Дистицим Протацид Экстра – 0,6 ед. ПС/г соевого шрота и 0,8 ед. ПС/г семян нута соответственно. Насыщающая концентрация субстрата во всех вариантах составила 100 мг/мл.

На заключительном этапе работы ферментативный гидролиз природных субстратов под действием исследуемых ферментных препаратов проводили при оптимальных условиях в течении 2-х часов. Оценку степени гидролиза и молекулярную массу продуктов протеолиза осуществляли методом гель-хроматографии. Для этого на колонку, заполненную гелем TSK gel Toyopearl HW-55F, наносили 5 мл супернатанта. Элюцию проводили дистиллированной водой. Фракционирование проб осуществляли на коллекторе фракций при 40 С в холодильной камере «Colora». Объем собираемых фракций – 4 мл. Регистрацию оптической плотности элюата во всех фракциях осуществляли при длине волны 280 нм на спектрофотометре.

В качестве контроля использовали водную вытяжку из исходного субстрата (тритикалевые и ржаные отруби; соевый шрот и цельносмолотый нут – гидромодуль 1:10). Результаты фракционирования продуктов протеолиза методом гель-хроматографии на колонке с Toyopearl gel HW-55F и соотношение фракций с различной молекулярной массой представлены в таблице 4.

Анализ полученных данных показывает, что все анализируемые ферментные препараты активно гидролизуют белки, при этом образуются продукты протеолиза различной молекулярной массы, варьируемой от 700000 до 1000 Дальтон. Изучение картины элюции позволило выявить семь основных пиков, которые характерны для белков с определенной молекулярной массой.

Значительную часть анализируемых белков составляют агломераты белков с молекулярной массой 700000 ÷ 350000 для всех вариантов. Необходимо также отметить, что соотношения различных фракций в разных вариантах сильно отличаются и зависят как от используемого ферментного препарата, его специфичности действия, так и от типа субстрата, то есть от природы белкового комплекса, его доступности для протеолитических ферментов. Однако выявлена общая тенденция, связанная с тем, что во всех гидролизатах, полученных с использованием ферментных препаратов на основе бактериальных протеаз, преобладают высоко- и средне – молекулярные продукты протеолиза; а при использовании микробных ферментных препаратов грибных протеаз, преобладают низкомолекулярные пептиды и аминокислоты.

Так, например, прирост низкомолекулярных фракций при действии ферментных препаратов бактериальных протеаз практически отсутствует, тогда как применение ферментных препаратов грибного происхождения увеличивает количество низкомолекулярных фракций в среднем в 1,5 -2,5 раза по сравнению с контролем.

Проведенные исследования показали, что ферментные препараты бактериального происхождения – «Нейтраза MG1,5» и «Алкалаза FG» имеют примерно одинаковую эффективность при гидролизе белков продуктов переработки зерновых и бобовых культур, при этом преимущественно (около 40 % от общего количества) образуются продукты протеолиза с молекулярной массой 300000 ÷ 50000 Да. Накопление низкомолекулярных продуктов протеолиза с молекулярной массой менее 25000 Да в наибольшей степени характерно для «Нейтраза MG1,5» при действии на белки ржаных отрубей; менее 1000 Да на белки тритикалевых отрубей.

Ферментные препараты грибного происхождения – «Протеаза GC-106» и «Дистицим Протацид Экстра», как отмечалось выше, проявляют высокую эффективность при гидролизе белков всех исследуемых зерновых субстратов с образованием большого количества низкомолекулярных продуктов протеолиза: с молекулярной массой менее 25000 Да – от 36 % для «Дистицим Протацид Экстра» при гидролизе белков нута и до 48,5 % для «Протеаза GC-106» при гидролизе белков соевого шрота.

Таким образом, исследуемые ферментные препараты могут быть использованы для направленной ферментативной модификации продуктов переработки зерновых и бобовых культур с целью получения белковых гидролизатов с определенным соотношением высоко-, средне-, низкомолекулярных пептидов и аминокислот. Они могут быть использованы при производстве широкого спектра продуктов питания общего, функционального и лечебно-профилактического назначения.
 
ЛИТЕРАТУРА
1. Витол И.С. Ферменты и их применение в пищевой промышленности / И.С. Витол, И.Б. Кобелева, С.Е. Траубенберг. – М.: ИК мгУПП. – 2000. – 82 с.
2. Витол, И.С. Ферментативная модификация муки тритикале с использованием протеолитических ферментных препаратов /И.С. Витол, Г.П. Карпиленко // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2015. – № 9. – С.17–22.
3. Мелешкина Е.П. Тритикале (технологии переработки). Монография / Е.П. Мелешкина, Г.Н. Панкратов, И.А. Панкратьева, Л.В. Чиркова, Р.Х. Кандроков, И.С. Витол, Н.А. Игорянова, О.В. Политуха, Д.Г. Туляков (под ред. Е.П. Мелешкиной). – М.: Изд-во ФЛИНТА. – 2018. – 188 с. ISBN 978–5–9765–3813–9.
4. Милорадова Е.В. Некоторые аспекты создания импортозамещающих технологий продуктов переработки сои / Е.В. Милорадова // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2008. – № 11. – С. 65–67.
5. Нечаев А.П. Пищевая химия. Лабораторный практикум / А.П. Нечаев, С.Е. Траубенберг, А.А. Кочеткова, В.В. Колпакова, И.С. Витол, И.Б. Кобелева, С.М. Северененко, И.В. Вяльцева. – СПб.: ГИОРД. – 2006. – 304 с.
6. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. – М.: Наука, 1985. – 536 с.
7. Римарева Л.В. Ферментные препараты и биокаталитические процессы в пищевой промышленности / Л.В. Римарева. Е.М. Серба, Е.Н. Соколова, Ю.А. Борщева, Н.И. Игнатова // Вопросы питания. – 2017. – Т. 86. – № 5. – С. 63–74.
8. Румянцева Г.Н. Влияние ферментных препаратов протеолитического действия на белоксодержащее сырье / Г.Н. Румянцева, М.Н. Евсеичева // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2005. – № 2. – С. 48.
9. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты: получение, состав, применение и их применение /Л.Я. Телишевская. М.: Аграрная наука. – 2000. – 259 с. ISBN 5–94129–001–2.
10. Толкачева А.А. Ферменты промышленного назначения – обзор рынка ферментных препаратов и перспективы его развития / А.А. Толкачева, Д.А. Черенков, О.С. Корнеева, П.Г. Пономарев // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. – 2017. – Т. 79. – № 4. – С. 197–203. DOI: 10.20914/2310– 1202–2017–4–197–203.
11. Meleshkina E.P. Innovative Trends in the Development of Advanced Triticale Grain Processing Technology / G.N. Pankratov, I.S. Vitol, R.H. Kandrokov, D.G. Tulyakov // Foods and Raw Materials. – 2017. – Vol. 5. – Issue 2. – РР. 70–82. DOI: 10.21179/2308–4057–2017–2–70–82.

И.С. Витол, Е.П. Мелешкина
ВНИИЗ – филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН,
г. Москва, Россия

Статья опубликована в журнале:
Актуальная биотехнология. - Воронеж, 2018.  – № 3 (26). – С. 306-310.
(в журнале напечатаны доклады конференции: Биотехнология: наука и практика: Сборник материалов VI международной научно-практической конференции, Ялта (Крым), 17-21 сентября 2018 г.)