Приборный вискозиметрический метод определения зараженности зерна возбудителями картофельной болезни хлеба

Картофельная болезнь хлеба сокращает период допустимого хранения хлеба, ухудшает его качество для потребителей, что приводит к заметным экономическим потерям производителей муки и хлеба, а главное – представляет угрозу здоровью человека. Исходя из этого зараженность пшеничной муки спорообразующими бактериями рода Bacillus – возбудителями картофельной болезни хлеба (КБХ) был введен как показатель безопасности в СанПиН 2.3.2. 1078-01 и в Технические регламенты Таможенного союза ТР ТС 021/2011 и ТР ТС 015/2011 [1, 2]. Не допускается использование на хлебопекарные цели пшеничной муки, хлеб из которой заболевает КБХ через 36 ч хранения при 370С. При этом признаки заболевания в пробных выпечках хлеба оцениваются органолептически, оценка носит субъективный характер и может приводить к ошибкам. Поэтому был разработан приборный метод обнаружения и количественной оценки картофельной болезни в хлебе, позволяющий объективно оценить зараженность муки возбудителями КБХ по пробным лабораторным выпечкам хлеба.

Использование вискозиметрического метода и нормативов на зерноперерабатывающих предприятиях позволит заблаговременно оценить санитарное состояние партий пшеницы, предназначенных  на хлебопекарный помол, что обеспечит рациональное  использование зерновых ресурсов и производство безопасной муки и хлебобулочных изделий, соответствующих по показателю «Зараженность возбудителем картофельной болезни хлеба» требованиям СанПиН и Технического регламента Таможенного союза[1-3].

Метод может быть также использован для санитарного контроля хлеба на хлебопекарных предприятиях и в торговой сети (в случае возникновения порчи хлеба) [3].
С помощью вискозиметрического метода обнаружена значительная распространенность возбудителей КБХ в товарных пробах муки: в 33% проб заболевание хлеба развивалось через 36 часов и ранее, а в 50% возникала после более продолжительного хранения хлеба (36-92 ч).

Зерно является основным источником обогащения муки спорообразующими бактериями (СБ). Ранее мы рассмотрели пути контаминации зерна СБ: они сводятся в основном к загрязнению его почвой и зерновой пылью при уборке и хранении, а также процессу самосогревания зерна, способствующему интенсивному развитию СБ в зерновой массе [4, 5]. В переработку могут поступать партии, содержащие до десятков тысяч спорообразующих бактерий в одном грамме. СБ обычно загрязняют поверхностные слои зерновки (оболочки), при помоле они частично переходят в муку. В зависимости от загрязненности зерна, технологии переработки и санитарного состояния предприятий содержания СБ в муке может колебаться от 20 до 80% от содержания в зерне; значительная часть СБ остается в отрубях. Поэтому при производстве пшеничной хлебопекарной муки большое значение приобретает заблаговременная оценки и использование в помольных смесях зерна пшеницы, слабо пораженного возбудителями картофельной болезни.

Таким образом, требовалась разработка адаптированного  к производственным условиям приборного метода оценки зараженности зерна возбудителями КБХ. Использование для этой цели вискозиметрического метода, разработанного  ранее для хлеба и муки, оказалось невозможным, поскольку спорообразующие бактерии в хранящемся кондиционном зерне находятся в анабиотическом состоянии в виде покоящихся спор, и не обладают активной альфа-амилазой. Синтез (или активация) альфа-амилазы происходит после прорастания спор и развития СБ в хлебном субстрате, он индуцируется субстратом – клейстеризованным крахмалом и приурочен к логарифмической фазе роста популяции СБ. Поэтому в вискозиметрический метод, предназначенный для зерна, был введен дополнительный этап накопительной культуры спорообразующих бактерий зерна на срезах хлеба, обеспечивающий образование ими активной альфа-амилазы.

Метод включает следующие этапы (рис. 1):

• приготовление смыва с зерна спорообразующих бактерий, присутствующих на нем;
• пастеризация смыва с зерна для уничтожения вегетативных клеток спорообразующих бактерий и других видов бактерий и для термоактивации спор;
• инокуляция срезов хлеба пастеризованными смывами с зерна и увлажнение контрольных срезов хлеба стерильной водой;
• накопительная культура спорообразующих бактерий зерна на срезах хлеба;
• экстракция индуцированной бактериальной альфа-амилазы из срезов хлеба: гомогенизация и фильтрование;
• измерение сравнительной активности альфа-амилазы в экстрактах хлеба (зараженного и контрольного) по скорости разжижения крахмала на приборе для определения числа падения (ПЧП);
• расчет разжижающей активности (РА).

Разжижающую активность  рассчитывают по формуле и выражают в %.

Таким образом, РА характеризует снижение вязкости крахмального клейстера под действием альфа-амилазы спорообразующих бактерий зерна, накопившейся в зараженных срезах хлеба в период инкубирования, и выраженное через изменение числа падения (ЧП). РА является интегральным показателем: она отражает как численность бактерий, так и их ферментативную активность. Средняя продолжительность определения РА составляет 14-15 часов (с учетом времени инкубирования срезов хлеба в термостате).
При разработке метода были оптимизированы условия выполнения отдельных рабочих этапов с целью увеличения чувствительности метода и сокращения его продолжительности.

Водный смыв зерна содержит сумму микроорганизмов, обитающих на его поверхности. Спорообразующие бактерии  составляют ничтожную часть этой микробиоты. Чтобы изолировать их, используется этап пастеризации, который обеспечивает гибель большинства вегетативных клеток и термоактивацию покоящихся спор. При пастеризации выживают лишь споры сравнительно термоустойчивых спорообразующих бактерий. Очень важно соблюдать режим пастеризации (800С, 10 минут), рекомендованный стандартом ICC при определении спор бактерий [6].

Этап накопительных культур СБ зерна на увлажненных инкубированных срезах хлеба обеспечивает рост бактерий и синтез альфа-амилазы, которую определяют по разжижающей активности на приборе ПЧП. Предварительно было установлено, что оптимальной температурой для синтеза альфа-амилазы в хлебе является температура 40оС. При этой температуре альфа-амилаза детектируется данным методом уже через 8,5-11 часов инкубирования. В прописи метода был принят срок 12 часов, гарантированно обеспечивающий определение РА при всех уровнях зараженности зерна СБ.

В качестве хлебного субстрата в накопительных культурах могут быть использованы срезы коммерческих нарезных батонов из муки в.с., достоверно не зараженных КБХ и не содержащих бактерицидных добавок. Предпочтительнее использовать для этой цели формовой хлеб пробных лабораторных выпечек.

Определение разжижающей активности альфа-амилазы, накопившейся в срезах хлеба, проводили на приборе ПЧП широко используемом для определения качества зерна и муки и свойств углеводно-амилазного комплекса [7-9].  В качестве субстрата фермента в пробирки вносили специально подобранный картофельный крахмал, источником фермента являлся экстракт из зараженного хлеба, объем которого обеспечивал измерение разжижающей активности при разных уровнях заражения зерна возбудителями КБХ.
Для уточнения связи величины РА бактериальной альфа-амилазы в накопительных культурах с интенсивностью развития картофельной болезни в хлебе были подобраны пробы зерна с разной зараженностью СБ: 0,2-9,9КОЕ/г?103. Из проб на лабораторной мельнице была выработана мука 1 сорта, и проведены пробные лабораторные выпечки хлеба [10]. Хлеб хранили при 37оС в провокационных условиях, в соответствии с инструкцией [11], периодически проверяя появление признаков КБХ, которые оценивали органолептически по пятибалльной шкале. Началом заболевания считали появление специфического запаха интенсивностью 0,5 балла.

Полученные результаты  приведены на рисунке 2. Наглядно видна тесная связь РА бактериальной альфа-амилазы с  количеством спорообразующих бактерий в зерне. По мере увеличения РА в пробе зерна резко сокращается время появления картофельной болезни в хлебе из этого зерна.

С помощью регрессионного анализа была выявлена тесная (полиномная и экспонециальная) зависимость времени возникновения КБХ и зараженности зерна возбудителями картофельной болезни от величины РА альфа-амилазы в испытуемых пробах зерна (R2=0.9769; R2=0,9862 соответственно) (Рис.3).

На основании установленных зависимостей были разработаны нормативы разжижающей активности альфа-амилазы для зерна пшеницы, определяющие сроки возникновения в хлебе, полученном из данного зерна, картофельной болезни.
На всех этапах (зерно, мука, хлеб) оценка риска возникновения КБХ производится по единому показателю – РА альфа-амилазы с использованием нормативов. Тем самым обеспечивается сквозной контроль показателя безопасности на всем пути, от поля до потребителя на основе единого принципа определения в сопоставимых единицах измерения.

ГНУ ВНИИЗ утвержден СТО 00932169.101-2013 «Зерновые культуры. Вискозиметрический метод определения зараженности зерна возбудителями картофельной болезни хлеба», дополнительные сведения, о котором, можно найти на сайте института ВНИИЗ.РФ.
Литература

1. СанПиН 2.3.2. 1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. –М.: Минздрав России, 2002. – 164с.
2. Технический регламент Таможенного союза 021/2011 (ТР ТС 021/2011) «О безопасности пищевой продукции».
3. Львова Л.С., Яицких А.В. Приборный вискозиметрический метод определения картофельной болезни в муке и хлебе //Хлебопродукты. – 2013 №
4. Мачихина Л.И., Алексеева Л.В., Львова Л.С. Научные основы продовольственной безопасности зерна (хранение и переработка). – М.: ДеЛи принт, 2007. – 382 с.
5. Львова Л.С., Яицких А.В. Источники загрязнения зерна спорообразующими бактериями – возбудителями «картофельной» болезни хлеба // Хлебопродукты. – 2013. – №9. – С. 57-59.
6. ICC Standart № 144 Enumeration of spores of mesophilic bacteria.
7.  Методы и приборы для определения качества заготовляемого и поставляемого в переработку зерна. Сборник ВНИИЗ /А. И. Мартьянова, Т. И. Очеретенко, А. И. Рыжова, И. Э. Жупахина, Г. Е. Гришина, Т. А. Леонова, Е. П. Мелешкина и др. / М., ВНИИЗ, 1992. - 132 с.
8. Мелешкина Е. П. Связь числа падения со свойствами углеводно-амилазного комплекса муки // Хлебопродукты. – 2005. - № 9. – С. 28 - 32.
9.  Мелешкина Е. П. ЧП, Автолитическая активность и амилограф // Хлебопродукты. – 2005. - № 10. – С. 24 - 25.
10. ГОСТ 27669-88 Мука пшеничная хлебопекарная. Метод пробной лабораторной выпечки хлеба.
11. Инструкция по предупреждению картофельной болезни хлеба на хлебопекарных предприятиях: ГНУ ГосНИИХП. – М.: 2012. – 32с.

---