Протеолитические ферменты и их белковые ингибиторы из зерна тритикале

Протеолитические ферменты играют значительную роль в различных физиологических процессах. Ключевая роль протеиназ проявляется не только в процессах деградации запасных белков, удалении "неправильных" белков, образующихся в результате мутаций и ошибок биосинтеза, но и участии в посттрансляционном процессинге белков, активации неактивных предшественников физиологически активных белков и пептидов, что свидетельствует о том, что протеиназы во многих случаях являются "пусковыми механизмами" ряда каскадных процессов и выполняют различные регуляторные функции. В настоящее время установлено, что протеолитические ферменты участвуют в процессах секреции, транспорта белковых веществ через биологические мембраны, адаптации клеточного метаболизма к изменениям внешней среды, в осуществлении защитных функций (Браудо, Даниленко, Дианова, Кроха, 2000; Мосолов, 1983).

Наряду с причинами физиологического характера интерес к протеолитическим ферментам обусловлен еще и тем, что они являются удобным объектом для изучения структуры белков, активных центров ферментов, механизмов регуляции ферментативной активности, других важных вопросов энзимологии и белковой химии. С практической точки зрения интерес к протеолитическим ферментам связан с их непосредственным участием в процессах, протекающих при хранении и переработки растительного сырья, а также применением препаратов протеаз в различных отраслях: сельском хозяйстве, пищевой промышленности, медицине.

На современном этапе развития наших представлений о роли пищи как фактора профилактики и лечения различных хронических заболеваний многочисленные открытия в пищевых продуктах веществ, обладающих профилактическими и лечебными свойствами (нутрицевтики), предопределили пересмотр приоритетов в пищевой технологии: если традиционно основной целью питания считалось удовлетворение потребностей человека в макро- и микронутриентах, то сегодня наряду с этим пищевые технологии должны ориентироваться на сохранение нативных свойств биологически ценных компонентов, в том числе и из растительного сырья, обладающих лечебно-профилактическими свойствами.

Все это в полной мере относится к технологиям получения белковых продуктов (концентратов и изолятов), которые не во всем отвечают указанной цели. Очевидно, что задача освобождения растительного сырья от нежелательных компонентов и обеспечения определенных функциональных свойств получаемых белковых продуктов сохраняет свою актуальность, однако необходим компромисс между сохранением пищевой ценности и улучшением функционально-технологических свойств растительных белковых продуктов.

В связи с этим большие возможности по модификации растительного сырья, в том числе зерна и продуктов его переработки, заключены в методах пищевой биотехнологии, которые принято подразделять на три группы: первая предусматривает модификацию сырья под действием микроорганизмов, вторая использование экзогенных ферментных препаратов, третья - использование собственных ферментов, преимущественно гидролитического действия.

На современном этапе наибольшее распространение получили методы ферментативной модификации зернового сырья с использованием микробных

ферментных препаратов протеолитического и целлюлолитичесого действия. Так, во Всероссийском НИИ зерна и продуктов его переработки - филиале "ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН разработаны способы ферментативной модификации биополимеров зерна тритикале и продуктов его переработки (отруби), которые позволяют получать продукты с различной степенью гидролиза белка и некрахмальных полисахаридов, обладающих определенными функционально - технологическими свойствами, что в конечном счете позволяет предположить широкий спектр областей их возможного применения - от хлебобулочных и мучных кондитерских изделий до мясных и молочных продуктов, напитков и соков (Витол, Мелешкина, Карпиленко, 2016; Витол, Мелешкина, Карпиленко, 2017; Meleshkina, Pankratov, Vitol, Kandrokov, Tulyakov, 2017).

В то же время исследованием собственных протеолитических ферментов, их выделение и очистка с целью использования для модификации эндогенных белков, к которым они проявляют наибольшее сродство, представляется весьма интересной задачей, в плане использования всего биопотенциала зерна и "экологичности" получаемых продуктов. Такое исследование неразрывно   сопряжено   с   изучением  белковых ингибиторов протеиназ, которые традиционно рассматривались лишь как антиалиментарные компоненты сырья и пищевых продуктов, но представляют исключительный интерес как фактор регуляции процесса протеолиза, не только in vivo, но и in vitro.

Таким образом, ферментативная модификация пищевого сырья, осуществляемая экзогенными ферментными препаратами или эндогенными ферментами может приводить к созданию продуктов с определенными функционально-технологическими свойствами и дополнительными физиологическими активностями, которые каждый раз должны быть предметом специального исследования.
Цель исследования - выделение, очистка и характеристика протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов из зерна тритикале.

Материалы и методы
В работе использовали зерно тритикале урожая 2016 г., предоставленное Донским зональным научно-исследовательским институтом сельского хозяйства.
Содержание растворимого белка определяли по методу Лоури, активность протеаз модифицированным методом Ансона с использованием в качестве субстрата бычего сывороточного альбумина.

Ингибирующую активность определяли по остаточной активности протеиназ (Нечаев, Траубенберг, Кочеткова, Колпакова, Витол, Кобелева, 2006). Фракционирование ферментов и их белковых ингибиторов проводили на колонке (2,3 х 35), заполненной гелем Toyopearl HW-55F, гель этой марки позволяет разделять белки с молекулярной массой от 1000 до 700000 Да. Предварительно колонку откалибровали для определения свободного (Vcb.) и общего (Vобщ.) объема колонки.

Свободный объем определяли по выходу декстрана синего (молекулярная масса около 2 млн. Да). Он составил 44 мл. Общий объем по выходу тирозина. Он составил 140 мл. Для определения молекулярной массы белков графическим методом колонку маркировали стандартными метчиками с известной молекулярной массой фирмы «Merck» (Германия) (Нечаев, Траубенберг, Кочеткова, Колпакова, Витол, Кобелева, 2006).

Результаты исследования и их обсуждение
Анализ имеющихся в литературе данных по выделению и очистке эндогенных протеаз зерна свидетельствует о том, что пик исследований в этой области пришелся на 70-е - 80-е годы 20-ого века. Работами отечественных и зарубежных исследователей показано наличие протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в покоящихся и прорастающих семенах зерновых (пшеница, ячмень, рожь, тритикале) (Исламов, Хакимжанов, Фурсов, 2004; Исламов, Хакимжанов, Фурсов, 2005; Meleshkina, Pankratov, Vitol, Kandrokov, Tulyakov, 2017) и бобовых культур (соя, фасоль, горох, маш, нут) (Асатулоев, Карпиленко, Витол, 2008; Мосолов, 1983). Некоторые из них выделены и очищены в достаточно высокой степени, доказана способность эндогенных протеиназ активно гидролизовать собственные белки, оказывать влияние не только на биохимические процессы при созревании и прорастании зерна, но и на процессы, связанные с деградацией белков зерна при его переработке. Выявлена регуляторная роль белковых ингибиторов в процессе протеолиза в покое и при прорастании зерна.

Новый виток интереса к эндогенным протеиназам и их белковым ингибиторам связан, как уже отмечалось выше, с возможностью их использования для ферментативной модификации биополимеров зерна и зернопродуктов.

Работы, проводимые во Всероссийском НИИ зерна и продуктов его переработки, показали, что в зерне тритикале наряду с кислыми протеиназами с оптимумом рН 3,5 присутствуют нейтральные и щелочные протеиназы с оптимумами рН 6,8 и 9,5 соответственно при гидролизе стандартного субстрата бычьего сывороточного альбумина (Витол, Кандроков, Стариченков, Коваль, Жильцова, 2015). Кроме того, выявлено, что активность кислых и нейтральных протеиназ в большей степени связана с белками, сосредоточенными в периферийных частях зерновки, очевидно, с белками алейронового слоя (Витол, Кандроков, Стариченков, Коваль, Жильцова, 2015).

Схема выделения эндогенных протеаз в виде комплексного препарата включала следующие стадии:

• Зерно тритикале подвергалось измельчению. К измельченному материалу (100% проход сита с диаметром 1 мм) добавляли 0,3596 раствор Na₂CC>3, в соотношении 1:10. Экстракцию проводили при интенсивном перемешивании на мешалке с гибким приводом при 4000 об/ мин в течение 5 мин.
• Полученную суспензию центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут. Осадок отбрасывали, надосадочную жидкость (супернатант) использовали для осаждения ферментов (протеаз).
• Осаждение проводили путем подкисления 5% лимонной кислотой до рН 4,5. Ранее было показано, что при таком значении рН осаждаются все протеолитические ферменты (кислые, нейтральные, щелочные).
• Формирование осадка проводили при температуре 4-6°С в течение 1 часа.
• Полученный осадок отделяли центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут, замораживали и высушивали из замороженного состояния (лиофильная сушка), что позволило сохранить активность выделяемых ферментов.

На всех этапах выделения активность протеаз определяли модифицированным методом Ансона, в качестве субстрата использовали бычий сывороточный альбумин.
В Таблице 1 приведены данные по содержанию белка, активности и степени их очистки на разных стадиях.

Данные Таблицы 1 показывают, что при осаждении нейтральных и кислых протеиназ подкислением происходит их очистка примерно в 5 - 5,5 раз.
Использование метода фракционирования белков, основанное на различиях в физико-химических свойствах отдельных белков, в частности метода гель-хроматографии на колонке с Toyopearl gel HW-55F, позволило разделить кислые, нейтральные и щелочные протеиназы зерна тритикале и определить их молекулярную массу в составе комплексного препарата. Для этого на колонку, заполненную гелем Toyopearl gel HW-55F, наносили 5 мл комплексного препарата протеиназ, перерастворенного в 0,35%-ном растворе Na₂C0₃n сконцентрированного в 10 раз. Объем собираемых фракций составлял 4 мл. Регистрацию оптической плотности элюата во фракциях осуществляли при длине волны 280 нм на спектрофотометре. Профили элюции и активность протеиназ представлены на Рисунке 1.


По результатам гель-хроматографии молекулярная масса кислых протеиназ - 75000 Да, нейтральных протеиназ - 250000 Да, щелочных - 50000 Да. При этом степень очистки составила соответственно 17,03; 15,03 и 27,03 раз.
Результаты исследований по характеристике очищенных препаратов протеаз из зерна тритикале суммированы в Таблице 2. Они свидетельствуют о том, что кислые и нейтральные протеиназы тритикале следует отнести к ферментам тиолового типа, поскольку они активируются цистеином и ингибируются п-хлормеркурийбензоатом (п-ХМБ) - специфическим ингибитором тиоловых ферментов; а щелочные протеиназы - к сериновым ферментам, поскольку они ингибируются специфическими ингибиторами сериновых ферментов - диизопропилфторфосфатом (ДФФ) и фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ). При этом их нельзя отнести к металлозависимым ферментам, так как этиленаминтетраацетат (ЭДТА) не оказывает влияния на их активность.


На следующем этапе работы проводили выделение и частичную очистку белковых ингибиторов эндогенных протеиназ из зерна тритикале. При разработке схемы выделения ингибиторов мы ориентировались на данные отечественных исследователей о том, что в над осадочной жидкости после экстракции водой из зерна пшеницы, ржи, сои, фасоли и осаждения протеаз при подкислении остаются белковые ингибиторы, подавляющие активность собственных протеолитических ферментов и активность трипсина (Мосолов, 1983). Аналогичные результаты были получены нами при изучении взаимодействия ингибиторов, выделенных подкислением в интервале рН от 4,5 до 3,0 с протеиназами тритикале и трипсина (Рис. 2).


При этом степень очистки белковых ингибиторов кислых и нейтральных протеиназ составила 26,6 раз; щелочных протеиназ - 25,0 раз; трипсина -21,9 раз.
Выделенные таким образом белковые ингибиторы фракционировали на колонке с Toyopearl gel HW-S5F. Полученные фракции анализировали на ингибирующую активность по отношению к собственным протеиназам и трипсину (Рис. 3).

Полученные данные показывают, что ингибитор трипсина и ингибитор щелочных протеиназ выходят в одной фракции с объемом элюции 88 мл и имеет молекулярную массу 30000 ¸ 35000 Да. Ингибиторы кислых и нейтральных протеиназ по данным метода гель-хроматографии, выходят с колонки с объемом элюции 96-100 мл и имеют молекулярную массу 15000¸20000 Да. Это является дополнительным косвенным подтверждением того, что ферменты, относящиеся к одному типу (трипсин и щелочные протеиназы тритикале -сериновые ферменты; кислые и нейтральные протеиназы тритикале - тиоловые ферменты) специфически ингибируются различными ингибиторами по конкурентному механизму ингибирования, то есть в образовании комплекса фермент-ингибитор участвуют активные центры изучаемых ферментов и ингибиторов.

На основании проведенных экспериментов разработана схема выделения белковых ингибиторов из зерна тритикале. Она включает следующие этапы:
Экстракция измельченного материала водой в соотношении 1:10 при интенсивном перемешивании на мешалке с гибким приводом при 4000 об/мин в течение 5 мин. Центрифугирование при 6000 об/ мин в течение 10 мин.

Подкисление водного экстракта до рН 4,5. Формирование осадка в течение 1 часа при температуре 4-6°С. Центрифугирование при 6000 об/мин в течение 10 мин (осадок - протеиназы; надосадочная жидкость - белковые ингибиторы).

Дальнейшее подкисление надосадочной жидкости до рН 3,0. Формирование осадка в течение 1 часа при температуре 4-6°С. Центрифугирование при 6000 об/мин в течение 10 мин. Перерастворение осадка в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,5.

Фракционирование белковых ингибиторов методом гель-хроматографии на колонке с Toyopearl gel HW-55F. Разделение ингибиторов трипсина и щелочной протеиназы тритикале и ингибиторов кислой и нейтральной протеиназ тритикале.

Заключение
В работе представлены экспериментальные данные по выделению,частичной очистке и характеристике протеолитических ферментов зерна тритикале, действующих в кислой нейтральной и щелочной областях рН.

Показано, что кислые и нейтральные протеиназы зерна тритикале являются ферментами тиолового типа, поскольку активируются цистеином и ингибируются п-хлормеркурий бензоатом специфическим ингибитором тиоловых ферментов. Щелочные протеиназы относятся к сериновым протеиназам, поскольку ингибируются специфическими ингибиторами сериновых ферментов - диизопропилфторфосфатом и фенилметилсульфонилфторидом. Методом гель-хроматографии определена молекулярная масса протеиназ зерна тритикале: кислые - 75000 Да, нейтральные - 250000 Да, щелочные - 50000 Да.

Предложена схема выделения и очистки белковых ингибиторов эндогенных протеиназ из зерна тритикале. Показана их способность подавлять активность собственных протеиназ и трипсина. Методом гель-хроматографии проведено разделение ингибиторов трипсина и щелочных протеиназ тритикале (с молекулярной массой 30000 ¸35000 Да) и ингибиторов кислых и нейтральных протеиназ тритикале (с молекулярной массой 15000¸20000 Да).

Принимая во внимание все вышеперечисленное, следует отметить, что частично очищенных препараты протеиназ и их белковых ингибиторов, полученные по предложенным схемам в дальнейшем могут быть использованы для ферментативной модификации растительных белков и регуляции процессов протеолиза в различных пищевых технологиях.

Литература
1. Асатулоев И. А., Карпиленко Г. П., Витол И. С. Белковые ингибиторы протеаз из семян нута //Хлебопродукты. 2008. № 1. С. 58-59.
2. Браудо Е. Е., Даниленко А. И., Дианова В. Т., Кроха Н. Г. Альтернативные подходы к получению растительных бенковых продуктов / в кн.: Растительный белок: новые перспективы   (под  ред.  Е.Е.  Браудо).     М.: Пищепромиздат, 2000. С. 6-23.
3. Витол И. С, Кандроков Р. X., Стариченков А. А., Коваль А. И., Жильцова Н. С. Белково-протеиназный комплекс зерна тритикале // Хранение и переработка сельхозсырья. 2015. № 8. С. 36-39.
4. Витол И. С, Мелешкина Е. П., Карпиленко Г. П. Биоконверсия тритикалевых отрубей с использованием ферментных препаратов целлюлолитического и протеолитического действия // Хранение и переработка сельхозсырья. 2016. № 10. С. 35-38.
5. Витол И. С, Мелешкина Е. П., Карпиленко Г. П. Функциональные свойства модифицированных продуктов переработки зерна тритикале // Хранение и переработка сельхозсырья. 2017. № 2. С. 27-29.
6. Исламов Р. А., Хакимжанов А. А., Фурсов О. В. Выделение ингибиторов сериновых протеаз и амилаз из зерна пшеницы // Биотехнология. Теория и практика. 2004. № 4. С. 117-122.
7. Исламов Р. А., Хакимжанов А. А., Фурсов О. В. Ингибитор трипсина из зерна пшеницы, выделенный аффинной хроматографией на трипсин-сефарозе // Биотехнология. Теория и практика. 2005. № 2. С. 71-75.
8. Meleshkina E. P., Pankratov G. N., Vitol I. S., Kandrokov R. H., Tulyakov D. G. Innovative Trends in the Development of Advanced Triticale Grain Processing Technology // Foods and Raw Materials. 2017. Vol.5. № 2. P. 70-82. DOI: 10.21179/2308-40S7-2017-2-70-82.
9. Мосолов В. В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза. М.: Наука, 1983.40 с.
10. Нечаев А. П., Траубенберг С. Е., Кочеткова А. А., Колпакова В. В., Витол И. С, Кобелева И. Б. Пищевая химия. Лабораторный практикум. СПб.: ГИОРД, 2006. 304 с.
 

Витол Ирина Сергеевна
кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник
Мелешкина Елена Павловна
доктор технических наук, директор
ВНИИЗ - филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН

Статья опубликована в журнале:
Хранение и переработка сельхозсырья (ХИПС). – 2018. - №3. – С.36-45.