Вискозиметрический метод определения «картофельной болезни» в муке и хлебе

Микробиологический характер «картофельной болезни» хлеба (КБХ) был впервые установлен в 1885 г., хотя первое описание возбудителя – Bacillus subtilis было дано еще в 1838 г. Возбудителями заболевания являются термотолерантные спорообразующие бактерии (СБ) p. Bacillus, преимущественно Bacillus subtilis и Bacillus subtilis asp. mesentericus, ранее объединявшиеся в группы картофельной и сенной палочек. Возможно участие и других видов СБ: В. mycoides, В. cereus, В. licheniformis, В. pumilus, В. polymyxa и пр. [1, 2].

Основные источники загрязнения зерна и зернопродуктов споровыми бактериями следующие:

• механическое загрязнение зерна почвой и зерновой пылью при уборке и хранении;
• самосогревание зерна при неблагоприятных условиях хранения, приводящее к увеличению числа СБ в сотни и тысячи раз;
• загрязнение муки при ее выработке на мельницах вследствие нарушения правил санитарии;
• нарушение технологического и санитарного режимов на хлебопекарных предприятиях. Использование контаминированных ингредиентов.

КБХ приводит к появлению специфического неприятного запаха и полному разрушению мякиша хлеба под действием гидролитических ферментов СБ. В результате ухудшается товарный вид и пищевая ценность продукта. Испорченный хлеб представляет собой опасность для здоровья человека ввиду накопления в нем миллионов условно-патогенных микроорганизмов и бактериальных токсинов.

При выпечке хлеба температура внутри буханки достигает на конечном этапе 98-100°С, что приводит к гибели основной массы мезофильных бактерий. Споры более термоустойчивых спорообразующих бактерий в этих условиях сохраняют жизнеспособность, развиваются при последующем хранении и вызывают КБХ. Для полной гибели спор необходимы более жесткие режимы термообработки: 6 ч при температуре 100°С, 45 мин при 113°С или 10 мин при 125°С [4].
Возникновению КБХ способствует кислотность, близкая к нейтральной, влажность мякиша 40-45%, температура 35-40°С. Жизнедеятельность В. subtilis в хлебе зависит от его влажности: она максимальна в сыром, плохо пропеченном хлебе (влажностью 48,5%) и минимальна при влажности хлеба 39%. Увеличение времени выпечки с 18 до 35 мин снижает активность спорообразующих бактерий в хлебе, также как и увеличение температуры пекарной камеры. Влияние этих факторов приводит как к уменьшению числа жизнеспособных спор в процессе выпечки, так и к ухудшению условий для их дальнейшего роста в готовом хлебе [5].

Согласно требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, а также дополнениям и изменениям к ним № 2, для пшеничной муки, используемой для выпечки хлеба пшеничных сортов, не допускается зараженность возбудителем КБХ через 36 ч после пробной лабораторной выпечки. Условия проведения пробной лабораторной выпечки установлены в ГОСТ 27669-88 и частично уточнены в Инструкции по предупреждению КБХ на хлебопекарных предприятиях.

Существующие методы контроля КБХ и ее возбудителей можно разделить на микробиологические, технологические и биохимические (ферментные), но одни из них достаточно трудоемкие и длительные, другие – не применимы для большинства предприятий, не оснащенных микробиологическими лабораториями или специальным оборудованием.

В производственных условиях обычно используют технологический метод по пробным лабораторным выпечкам, основанный на органолептической оценке признаков КБХ. При этом оценка носит субъективный характер и поэтому часто является спорной.
Предложенный ГОСНИИХП люминесцентный метод обнаружения КБХ в хлебе не может рассматриваться как количественный, поскольку лишь часть колоний СБ обладает желтой или розовой флуоресценцией; связь флуоресценции со способностью вызывать КБХ не установлена [8].

Все спорообразующие бактерии p. Bacillus обладают активными гидролитическими ферментами: протеазами, липазами, амилазами. Амилолитические ферменты В. subtilis представлены ?-амилазой и ?-глюкоамилазой, причем бактериальная ?-амилаза в 25-100 раз активнее солодовой. На первом этапе ?-амилаза гидролизует крахмал до декстринов, происходит быстрое падение вязкости крахмального геля, что приводит к увеличению заминаемости мякиша хлеба, его липкости, образованию очагов и провалов в мякише хлеба [5, 9, 10].

Это свойство бактериальной ^а-амилазы было использовано нами при разработке количественного вискозиметрического метода обнаружения «картофельной болезни» в хлебе. Метод основан на измерении снижения вязкости крахмального клейстера под действием бактериальной ^А-амилазы, присутствующей в экстракте из пораженного хлеба, с помощью прибора для определения числа падения ПЧП-3 (или его аналога).

Метод включает следующие этапы (рис. 1):

• пробная лабораторная или промышленная выпечка хлеба;
• отбор проб мякиша от свежевыпеченного хлеба и хлеба, хранившегося в провокационных условиях при 37°С;
• водная экстракция бактериальной ?-амилазы из проб мякиша хлеба на блендере;
• определение числа падения (ЧП) картофельного крахмала с экстрактами свежего и хранившегося хлеба на приборе ПЧП;
• расчет разжижающей активности (РА) бактериальной ?-амилазы по разнице значений ЧП свежего и хранившегося хлеба:

Под РА бактериальной Альфа-амилазы подразумевается снижение значений ЧП клейстеризованного картофельного крахмала под действием водного экстракта из хлеба, хранившегося в провокационных условиях и пораженного споровыми бактериями, выраженное в % от ЧП свежевыпеченного хлеба и измеренное на приборе ПЧП-3.

Для апробации метода были проверены 26 проб муки коммерческой и выработанной из зерна, загрязненного спорами В. subtilis. Из проб проводили пробные лабораторные выпечки по ГОСТ 27669-88, формовые хлеба хранили в увлажненных условиях при 37°С в течение 60-90 ч. В пробах муки, теста и хлеба в период хранения определяли содержание спорообразующих бактерий, РА ?-амилазы, а также органолептические признаки КБХ.

В целом 83,3% хлебов, выпеченных из коммерческих проб муки, в той или иной степени были поражены КБХ, что свидетельствует о широкой распространенности заболевания. В 33,3% проб заболевание хлеба возникло через 36 ч и менее, в остальных – после более продолжительного срока хранения(36-92 ч). Изделия первой группы были отнесены к пораженным КБХ пробам, второй группы – к кондиционным (см. таблицу).
Исходные уровни заражения СБ коммерческих проб муки были низкими (0,16-0,20 КОЕ/МО3) и не различались в пораженных и кондиционных пробах. Их величина в указанных пределах не влияла на скорость и интенсивность развития КБХ.

По-видимому, зараженность муки СБ в пределах до 0,5 КОЕ/г·103 (т.е. 500 КОЕ/г), чаще всего встречающаяся в коммерческой муке, не влияет на частоту и интенсивность заболевания хлеба «картофельной болезнью». Определяющим фактором является скорость размножения в хлебе СБ, синтез бактериями ?-амилазы и, вероятно, других ферментов, формирующих запах КБХ. Положительная зависимость развития КБХ от содержания СБ в муке наблюдается при более высоких уровнях споровой нагрузки.

Установлена тесная связь картофельной болезни с биохимическими (РА) и микробиологическими процессами, протекающими в хлебе. С первых часов хранения в хлебе наблюдался логарифмический рост СБ, количество бактерий возрастало в 50-100 раз за 12 ч. С некоторым отставанием (через 12-16 ч) начинался  индуцированный  синтез  бактериальной ?-амилазы, и только через 31-48 ч проявлялись первые визуальные признаки КБХ.

С помощью регрессионного анализа установлена зависимость между значением РА и накоплением спорообразующих бактерий в хлебе (R2=0,873), а также интенсивностью (R2= 0,898) «картофельной болезни» (рис. 2). Динамика нарастания РА зависит от скорости размножения СБ и их ферментной активности. Активные популяции, присутствующие в пораженных пробах, вызывали визуальные признаки КБХ через 24-36 ч и характеризовались быстрым размножением в хлебе, ранним синтезом и высокой активностью ?-амилазы. Кондиционные пробы существенно отставали по этим показателям (рис. 3). Были разработаны нормы РА, соответствующие органолептической оценке КБХ. В свежевыпеченном хлебе величина РА колеблется в пределах ошибки определения (0-10%). Значения РА свыше 10-20% характеризуют начало гидролиза крахмала споровыми бактериями.

Началом развития КБХ в хлебе следует считать значение РА > 20%, а первые органолептические признаки (0,5 балла) обнаруживаются при РА, равном 40 ± 10%, и при содержании СБ в пределах 3-6,4 млн КОЕ/г. В явно испорченном хлебе (КБХ 1 балл) РА составляет 76 ± 16%, число бактерий в нем достигает 100-250 млн КОЕ/г, что совпадает с данными других исследователей [11].

Вискозиметрический метод характеризуется высокой внутрилабораторной сходимостью результатов параллельных определений РА. При анализе одной буханки хлеба допускаемое относительное расхождение результатов параллельных определений (Rr) в рабочей зоне измерений при Р = 0,95 составляет 20% (относительных), т.е. х = ±10%.

К преимуществам вискозиметрического метода определения КБХ относятся:

• быстрота и простота приборного измерения. На всю процедуру требуется около 20 мин;
• объективность и точность определения РА;
• возможность заблаговременной индикации КБХ и выбраковки зараженного хлеба за 10-13 ч до органолептического обнаружения первых признаков КБХ;
• возможность контроля муки и хлеба при их производстве с помощью прибора для определения числа падения, которыми обеспечено большинство предприятий зерновой отрасли.

Разработанный метод можно использовать:

• для гигиенической оценки (в соответствии с требованием СанПиН) зараженности пшеничной хлебопекарной муки возбудителями КБХ вместо органолептической оценки пробных лабораторных выпечек;
• в хлебопекарном производстве – для периодического контроля сырья и готовой продукции;
• в торговой сети – при возникновении в хлебе вспышек «картофельной болезни»: в спорных и арбитражных случаях.

   Использование вискозиметрического метода снижает риск заболевания хлеба (КБХ) в результате достоверной оценки загрязнения хлебопекарной муки возбудителями болезни и обеспечивает безопасность потребителей за счет быстрой объективной оценки пораженности муки и хлеба «картофельной болезнью», заблаговременного исключения из потребления хлеба с высокими уровнями бактеризации (50-100 млн КОЕ/г), которые представляют потенциальный риск для населения ввиду патогенности ряда видов и штаммов спорообразующих бактерий – возбудителей КБХ.

   ГНУ ВНИИЗ Россельхозакадемии утвержден СТО 00932169.103-2013 «Приборный вискозиметрический метод оценки поражения муки и хлеба «картофельной болезнью», дополнительные сведения о котором можно найти на сайте института: vniiz.org

Литература
1.  Ауэрман, Л.Я. Технология хлебопекарного производства / Л.Я. Ауэрман. – 9-е изд., перераб. и доп. – С.-Пб.: Професия, 2002. – 416 с.
2.  Афанасьева, О.В. Микробиологический контроль хлебопекарного производства / О.В. Афанасьева. – М.: Пищепромиздат, 1976. – С.52-59.
3. Демчук, А.П. Методы выявления и предупреждения «картофельной болезни» хлеба / А.П. Демчук, И.М. Ройтер. – М.: ЦНИИТЭИ Пищепром, 1997. – 41 с.
4.   Львова, Л.С. Источники загрязнения зерна спорообразующими бактериями – возбудителями «картофельной» болезни хлеба / Л.С. Львова, А.В. Яицких//Хлебопродукты. – 2013. – № 9. – С. 57-59.
5.   Фениксова, Р.В. Биохимические основы получения и применения ферментных препаратов: учеб. пособ. «Техническая биохимия» / Р.В. Фениксова. – М.: Высшая школа, 1973. – С. 375-453.
6.   Coleman,   G.   Studies on -ос-amylase formation by Bacillus subtilis / G. Coleman, W.H. Elliot // Biochem. J. –1962. – V.83. – P. 256.
7. Pepe, O. Rope – producing strains of Bacillus spp. from wheat bread and strategy for their control by lactic acid bacteria / O. Pepe, G. Blaiotta et al // Appl. Environ. Microbiol. – 2003. – Vol. 4 69. – №4. – P. 2321-2329.
8.  Rosenkvist, H. Contamination profiles and characterization of Bacillus species in wheat bread and =j raw materials for bread production / H. Rosenkvist, A. Hansen // Int. J. Food J Microbiol. – 1995. – Vol. 26. – № 3. – P. 353-363.

---