Эффективность целлюлолитических ферментных препаратов при биоконверсии оболочек белого люпина

Введение
Белый люпин (Lupinus albus L.) относится к числу древнейших сельскохозяйственных культур, однако для России эта культура сравнительно новая, только в начале 60-х годов 20 века приступили к его исследованиям в условиях Центрального Черноземья [9].

В настоящее время в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в Российской Федерации, включено 11 сортов белого люпина, в том числе и сорт Дега (рис.1), который был создан в РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева совместно с Всероссийским НИИ люпина и включен в Госреестр с 2004 года [5].

Многочисленные опыты показали, что белый люпин превосходит другие зернобобовые культуры, включая сою, узколистный люпин, горох, вику яровую, кормовые бобы по урожайности и по сбору белка с 1 га – в 1,5-2,0 раза [4,11]. Биохимические показатели зерна белого люпина дают основание утверждать, что белый люпин для России можно рассматривать, как источник растительного белка дополнительно к сое, или как альтернативу ей [9,10]. В таблице 1 приведены сравнительные характеристики химического состава зерна белого люпина и его анатомических частей [9].

Данные таблицы свидетельствуют о высокой пищевой ценности зерна белого люпина, а именно: о высоком содержании белка как в целом зерне (39,5%), так и ядре без оболочек (46,2%); достаточно высоком по сравнению со злаковыми культурами содержанием жира – 7,2 и 8,5 и сравнительно невысоким содержанием клетчатки – 9,1 и 2,3 соответственно.


Сорта люпина современной селекции отличаются отсутствием белковых ингибиторов трипсина и низким содержанием алкалоидов, что позволяет использовать зерно белого люпина в кормах без предварительной тепловой обработки [1,7]. Имеющиеся данные из различных литературных источников подтверждают эффективность применения зерна белого люпина (как дробленного, так и обрушенного) в комбикормах в различных отраслях животноводства: птицеводстве, свиноводстве, мясном и молочном скотоводстве, рыболовстве [1,6,10].

Однако, на наш взгляд, следует обратить внимание и на оболочки люпина, получаемые после обрушения целого зерна: они представляют собой отличный объект для ферментативной модификации, поскольку содержат достаточное количества белка (9,2%) и высокое – клетчатки (37,9%), а при мягких режимах ферментативного гидролиза основных биополимеров содержащиеся в оболочках макро-, микроэлементы и витамины будут сохранены.

Ферментативная модификация белков растительного сырья представляет собой важный этап в перспективных технологиях глубокой переработки. В результате модификации (ферментативный гидролиз) биополимеров растительного сырья и вторичных продуктов его переработки могут быть получены продукты, обладающие более высокой степенью усвоения, и, следовательно, повышенной биологической ценностью [2].

Однако, известно, что ферменты и ферментные препараты, обладающие специфичностью действия, осуществляют гидролиз различных субстратов с разной степенью эффективности (скорость и глубина гидролиза). Следует также учитывать, что при традиционной характеристике ферментных препаратов выявление оптимума температуры и рН, как и других кинетических параметров, проводится с использованием стандартного субстрата. Вместе с тем, в условиях, когда в качестве субстрата выступает сложная гетерогенная система, которая влияет на характер протекания ферментативного процесса, основные кинетические параметры ферментативной реакции изменяются [2,3].
Цель исследования – оценка эффективности ферментных препаратов целлюлолитического действия при биоконверсии оболочек белого люпина.

Объекты и методы исследования
В работе использовали оболочки зерна белого люпина сорта Дега, полученные путем обрушения – измельчения на центробежном шелушителе и последующей пневмосепарации с отвеиванием оболочек [8].
Содержание белка определяли по методу Къельдаля – ГОСТ 10846-91; клетчатки – методом Кюшнера и Ганека; определение фракционного состава белков – по Осборну, растворимого белка – по методу Лоури; восстанавливающих сахаров – по методу Бертрана [8].

Принимая во внимание сложное строение клеточной стенки, для ее деградации и увеличения степени извлечения белка требуются ферментные препараты, обладающие целым комплексом активностей: целлюлазной, гемицеллюлазной и пектолитической и др.

В качестве ферментных препаратов использовали:

• «Шеарзим 500 L» (Novozymes, Дания) – препарат эндоксилоназы, действующий только на растворимые пентозаны зерна, резко снижает вязкость.
• «Вискоферм L» (Novozymes, Дания) – представляет собой мультиэнзимный комплекс, содержащий широкий спектр карбогидраз, включая арабиназу, целлюлазу, β-глюканазу и ксиланазу. Препарат имеет также пектолитическую активность.
• «Целловиридин Г20Х» (Бердский завод биопрепаратов, Россия) – комплекс ферментов карбогидраз штамма Trichoderma reesei (viride). Способен к глубокой деструкции как клеточных стенок, так и отдельных полисахаридов растений: целлюлозы, глюкана, ксилана, гемицеллюлозы и других некрахмалистых полисахаридов; существенным образом превосходит фермент, ранее выпускаемый с таким же названием, не только по целлюлолитической активности (в 40 раз больше), но и по содержанию β-глюканазы.
• «Дистицим GL» (Erbslön, Германия) – препарат из генетически модифицированного штамма Trichoderma reesei. Основная активность определяется действием нескольких термотолерантных гемицеллюлаз и β-глюконазы. Является преимущественно эндоферментом, гидролизует β-1,4 и β-1,3-гликозидные связи в целлюлозе, гемицеллюлозах и β-глюканах.

Все ферментные препараты рекомендованы для гидролиза биополимеров зернового сырья.

Результаты и их обсуждение
На первом этапе изучали основные биохимические показатели исследуемых оболочек белого люпина сорта Дега с позиции их использования в качестве объекта для ферментативной модификации. Общее содержание белка (N×6,25) – 9,13%; клетчатки – 38,2%; растворимого белка – 0,350 мг/мл; восстанавливающих сахаров – 0,75%.

При определении фракционного состава бел- ков оболочек белого люпина сорта Дега по Осборну альбумины выделяли дистиллированной водой, глобулины – 10%-м раствором NaCl, проламины – 70%-м этанолом, глютелины – 0,2%-м раствором NaOH [8]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что на долю альбуминово-глобулиновой фракции приходится до 70,15% от общего содержания белка. При этом фракция альбуминов составляет 32,87%; глобулинов – 37,28%. Проламины в оболочках белого люпина практически отсутствуют, на долю глютелинов приходится 8,73%; нерастворимый остаток – 21,12%. Последнее свидетельствует о том, что достаточное количество белков находится в связанном состоянии, в том числе и с некрахмальными полисахаридами, которые в большом количестве содержатся в оболочках зерна.

На втором этапе изучали основные кинетические параметры ферментативной реакции гидролиза некрахмальных полисахаридов оболочек белого люпина при действии микробных ферментных препаратов (табл. 2). Оптимумы температуры и рН были выявлены при изучении активности в диапазоне 20-80ºС и рН 3,0-8,0.


На заключительном этапе оценивали эффективность действия исследуемых ферментных препаратов. Для этого ферментативный гидролиз проводили при оптимальных условиях, которые были подобраны экспериментально. Инкубационная смесь состояла из отрубей, воды (гидромодуль 1:10), соответствующего буфера (20% от объема) и ферментного препарата из расчета конечной концентрации, соответствующей оптимальной. Отбор проб проводили через каждые 30 мин в течение 2-х часов, переносили в центрифужные стаканчики и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость использовали для определения восстанавливающих сахаров (редуцирующих веществ, РВ) по методу Бертрана и количества растворимого белка по методу Лоури [8].




Анализ данных диаграмм, представленных на рисунках 2 и 3 свидетельствуют о том, что наибольшую эффективность при гидролизе некрахмальных полисахаридов оболочек белого люпина проявляют ферментные препараты «Дистицим GL» и «Шеарзим 500L» – количество восстанавливающих сахаров увеличилось в 3,20 и 2,85 раза соответственно. Ферментные препараты «Виско- ферм L» и «Целловиридин Г20X» в 1,2-1,6 раз менее эффективны. При этом следует отметить, что для всех исследуемых ферментных препаратов максимальная эффективность достигается при полуторачасовом гидролизе.

Максимальное накопление растворимого белка закономерно наблюдается при использовании ферментного препарата «Дистицим GL» уже при 60-тиминутном гидролизе, при этом количество растворимого белка превосходит исходное содержание в оболочках белого люпина в 11 раз. Эффективность препаратов «Вискоферм L» и «Шеарзим 500L» несколько уступает эффективности препарата «Дистицим GL» – увеличение составляет 9 и 8 раз соответственно, но уже при двухчасовом гидролизе. Наименьшую эффективность при накоплении растворимого белка из всех исследуемых ферментных препаратов, как и в случае с восстанавливающими сахарами, проявляет «Целловиридин Г20X», тем не менее при двухчасовом гидролизе количество растворимого белка увеличилось в 5 раз.

Заключение
Полученные данные свидетельствуют о возможности использования исследуемых препаратов при ферментативной модификации биополимеров оболочек белого люпина как по отдельности, так и в составе мультиэнзимных композиций на основе целлюлолитических и протеолитических ферментных препаратов. Это позволит существенно увеличить степень усвоения, а, следовательно, и биологическую ценность вторичных продуктов переработки зерна белого люпина при их использовании в кормах, а при более детальном изучении полученных гидролизатов, возможно, и как функционально-технологических компонентов с определенными свойствами при создании новых пищевых продуктов.

Список литературы
1. Афанасьев Т.Д., Штеле А.Л., Терехов В.А., Писарев Е.В. Использование зерна белого люпи-на при выращивании перепелов на мясо // Достижения науки и техники АПК. – 2011. – № 9. – С. 43-45.
2. Витол И.С., Кобелева И.Б., Траубенберг С.Е. Ферменты и их применение в пищевой промышленности. – М.: ИК МГУПП. – 2000. – 82 с.
3. Витол И.С., Мелешкина Е.П., Карпиленко Г.П. Биоконверсия тритикалевых отрубей с использованием ферментных препаратов целлюлолитического и протеолитического действия // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2016. – № 10. – С.35-38.
4. Гатаулина Г.Г., Медведева Н.В., Штеле АЛ, Цыгуткин А.С. Рост, развитие, урожайность и кормовая ценность сортов белого люпина (Lupinus albus L.) селекции РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева // Известия ТСХА. – 2013. – Вып. 6. – С. 12-30.
5. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию. Т.1. Сорта растений (офиц. изд.). – М.: ФГБНУ «Росинформагротех». – 2017. – С. 84 с.
6. Егоров Н.А., Андрианова Е.Н., Цыгуткин А.С, Штеле А.Л. Белый люпин и другие зернобобовые культуры в кормлении птицы // Достижения науки и техники АПК. – 2010. – № 9. – С. 36-38.
7. Зверев С.В., Сесикашвили О.Ш. Первичная переработка зерна белого люпина. – Кутаиси: Изд-во Государственного Университета Акакия Церетели. – 2016. – 82 с. ISBN 978-9941-417-96-2.
8. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А., Колпакова В.В., Витол И.С., Кобелева И.Б. Пищевая химия. Лабораторный практикум. – СПб.: ГИОРД. – 2006. – 304 с.
9. Цыгуткин А.С, Штеле А.Л., Андрианова Е.Н., Медведева Н.В. Аминокислотный состав зерна белого люпина сортов Гамма и Дега //Достижения науки и техники АПК. – 2011. – № 9. – С. 41-43.
10. Штеле А.Л., Терехов В.А., Кузнецов А.С. Белый люпин с ферментными препаратами в комбикормах для бройлеров // Достижения науки и техники АПК. – 2012. – № 10. – С. 48-50.
11. Kurlovich B.S., Earnshaw P., Lepkovich I., Suchanov B., Chirimanova T., Nazarova N., Pilipenko S. Genetic, environmental and agro technical influences on lupin (Lupinus L.) at study in Russia and on the Ukraine / in: Proc. International Scientifi c Conference devoted 10 years anniversary of the International Academy «Information, Communication, Control on Engineering, Nature, Society», 2004, April, 23. – Sankt Petersburg, Publishing house «Radius» – 2004. – P. 27-30.
 

ВИТОЛ Ирина Сергеевна, канд. биол. наук, доцент,
ЗВЕРЕВ Сергей Васильевич, д-р. техн. наук, профессор,
ВНИИЗ – филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых си- стем им. В.М. Горбатова» РАН

Статья опубликована в журнале:
Вестник Рязанского государственного агротехнологического университета имени П.А. Костычева. – 2018. - №2(38). – С.77-81