Оценка продуктов протеолиза белков отрубей при их ферментативной модификации по молекулярной массе

Ферментативная модификация вторичных продуктов переработки зернового сырья, представляет собой важный этап в перспективных технологиях глубокой переработки. В результате модификации (ферментативный гидролиз) биополимеров растительного сырья могут быть получены продукты, обладающие более высокой степенью усвоения, а, следовательно, повышенной биологической ценностью [2, 4].

Однако, известно, что ферменты и ферментные препараты, обладающие специфичностью действия, осуществляют гидролиз различных субстратов в разной степенью эффективности (скорость и глубина гидролиза) [2, 3].

Цель исследования – оценка молекулярной массы продуктов протеолиза белков тритикалевых и ржаных отрубей под действием мультэнзимных композиций (МЭК) на основе ферментных препаратов целлюлолитического и протеолитического действия.

В работе использовали тритикалевые и ржаные отруби. В качестве ферментных препаратов целлюлолитического действия, необходимых для увеличения степени извлечения белка, использовали:
  • «Шеарзим 500 L» (Novozymes, Дания) – препарат эндоксилоназы, действующий только на растворимые пентозаны зерна, резко снижает вязкость;
  • «Вискоферм L» (Novozymes, Дания) – представляет собой мультиэнзимный комплекс, содержащий широкий спектр карбогидраз, включая арабиназу, целлюлазу, β-глюканазу и ксиланазу. Препарат имеет также пектолитическую активность. В качестве ферментных препаратов протеолитического действия:
  • «Нейтраза MG 1,5» (Novozymes, Дания) – бактериальная металлопротеиназа (Zn), продуцируемая Bacillus amyloliquefaciens. Это эндопротеаза, которую рекомендуют использовать в случаях, когда протеинсодержащий комплекс должен быть более или менее экстенсивно разложен до пептидов;
  • «Дистицим Протацид Экстра» (Дëлер, Германия) – грибная протеаза, продуцируемая Aspergillus niger. Все ферментные препараты рекомендованы для гидролиза биополимеров зернового сырья. На основе проведенных исследований по изучению основных кинетических характеристик ферментных препаратов и эффективности их действия на биополимеры тритикалевых и ржаных отрубей, научно обосновано применение следующих мультэнзимных композиций):
  • МЭК 1 – «Шеарзим 500L» + «Нейтраза 1,5MG»;
  • МЭК 2 – «Вискоферм L» + «Дистицим Протацид Экстра».


Выбор ферментных препаратов обусловлен различной специфичностью действия и примерно одинаковыми оптимумами действия: оптимум температуры – 50ºС; рН 5,5–6,0 для МЭК-1 и 40 ºС; рН 3,5 для МЭК-2.

Гидролиз проводили в 2-а этапа, продолжительность каждого этапа – 2 часа. На первом этапе вносили целлюлолитический ферментный препарат. На втором этапе – ферментный препарат протеолитического действия. Дозировка ферментных препаратов и концентрация субстрата, продолжительность каждого этапа были подобраны экспериментально [1, 2, 4].

Оценку молекулярной массы проводили с помощью метода гель-хроматографии. Для этого на колонку, заполненную Toyopearl gel HW-55F, наносили 5 мл образца. Элюцию проводили дистиллированной водой. В качестве контроля использовали водную вытяжку из отрубей – гидромодуль 1:10. Результаты фракционирования продуктов протеолиза методом гель-хроматографии на колонке с Toyopearl gel HW-55F представлены на рисунках 1, 2 и в таблице 1.





Данные, представленные на рисунках 1 и 2, показывают, что все анализируемые образцы характеризуются большим разнообразием белков и продуктов протеолиза под действием МЭК-1 и МЭК-2 различной молекулярной массы, варьируемой от 700000 до 1000 Дальтон. При этом можно выделить семь основных пиков, которые характерны для белков с определенной молекулярной массой.

В таблице 1 представлены данные по молекулярной массе белков, пептидов, которые были определены графическим методом с использованием калибровочной кривой. Значительную часть анализируемых белков составляют агломераты белков с молекулярной массой 700000 ÷ 350000. При ферментативной модификации их количество снижается примерно в 1,5 и 2,0 раза соответственно для МЭК-1 и МЭК-2.

Фракция с молекулярной массой 100000 ÷ 50000 Да (IV пик) в образцах с модифицированными белками тритикалевых отрубей полностью отсутствует, хотя в контрольном варианте на ее долю приходится 13,26 %. Также в варианте с использованием МЭК-2 отсутствует фракция пептидов с массой 25000 ÷ 1500 Да (VI пик).

Обращает на себя внимание и резкое снижение количества низкомолекулярных белков и высокомолекулярных пептидов с массой 50000 ÷ 25000 Да, примерно в 2–5 раз, а также средне- и низкомолекулярных пептидов с массой 25000 ÷ 1500 Да.
Аналогичные исследования были проведены с ржаными отрубями. Профили элюции продуктов протеолиза при гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-75 представлены на рисунке 3.



Данные представленные на рисунке 3 показывают, что все анализируемые образцы характеризуются большим разнообразием белков и продуктов протеолиза под действием МЭК-1 и МЭК-2 различной молекулярной массы, варьируемой от 70000 до 3000 Дальтон и менее. При этом можно выделить пять основных пиков, которые характерны для белков и пептидов с определенной молекулярной массой.


В таблице 2 представлены данные по молекулярной массе полученных продуктов протеолиза. Значительную часть анализируемых белков составляют белки с молекулярной массой выше 70000. При ферментативной модификации их количество снижается примерно в 1,7 и 2,3 раза соответственно для МЭК-1 и МЭК-2.

Фракция с молекулярной массой 40000 ÷ 35000 Да (II пик) в образцах с модифицированными белками ржаных отрубей незначительно снижается и составляет 5,30 % для МЭК1 и 4,02 % для МЭК 2 против 6,49 % в контроле.
Обращает на себя внимание резкое увеличение количества продуктов протеолиза под действием МЭК-1 с молекулярной массой 30000 ÷ 20000 Да (III пик) – в 6,1 раза; и продуктов протеолиза под действием МЭК-2 – в 2,3 раза. Доля фракция продуктов протеолиза с молекулярной массой 20000 ÷ 10000 Да (IV пик) снижается в обоих случаях на 3,7 % (МЭК-1) и 7,2 % (МЭК-2). Накопление низкомолекулярных продуктов протеолиза с молекулярной массой менее 3000 Да (V пик) происходит преимущественно под действием МЭК-2, увеличивая их содержание примерно в 2 раза по сравнению с контролем.

Полученные данные свидетельствуют о высокой степени и глубине гидролиза белков ржаных отрубей с использованием композиций целлюлолитических и протеолитических ферментов. При этом методом гель-хроматографии показано, что при использовании МЭК-1 (Шеарзим 500 L + Нейтраза MG 1,5) во всех гидролизатах преобладают высоко- и средне- молекулярные продукты протеолиза; а при использовании МЭК-2 (Вискоферм L + Дистицим Протацид Экстра) низкомолекулярные пептиды и аминокислоты. Доля низкомолекулярных азотистых соединений увеличилась в результате ферментативной модификации тритикалевых отрубей в 4–5 раз, ржаных отрубей в 2 раза.

Список используемой литературы:
1. Витол, И.С. Ферменты и их применение в пищевой промышленности / И.С. Витол, И.Б. Кобелева, С.Е. Траубенберг. – М.: ИК МГУПП. – 2000. – 82 с.
2. Витол, И.С. Биоконверсия тритикалевых отрубей с использованием ферментных препаратов целлюлолитического и протеолитического действия / И.С. Витол, Е.П. Мелешкина, Г.П. Карпиленко // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2016. – № 10. – С.35-38.
3. Мелешкина, Е.П. Продукты переработки зерна тритикале как объект для ферментативной модификации / Е.П. Мелешкина, И.С. Витол, Р.Х. Кандроков // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2016. – № 9. – С.14-18.
4. Meleshkina, E.P. Innovative Trends in the Development of Advanced Triticale Grain Processing Technology / G.N. Pankratov, I.S. Vitol, R.H. Kandrokov, D.G.Tulyakov // Foods and Raw Materials. – 2017. – Vol. 5. – Issue 2. – РР. 70-82. DOI: 10.21179/2308-4057-2017- 2-70-82.
 

Султанов И.В., Витол И.С., к.б.н., доц. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет пищевых производств»

Статья опубликована в сборнике:
Биотехнология и продукты биоорганического синтеза: сборник материалов национальной научно-практической конференции, 24 апреля 2018 г. – М.: МГУПП, 2018. – С.93-97.


 
Наверх ↑