Биоконверсия тритикалевых отрубей с использованием ферментных препаратов целлюлолитического и протеолитического действия

В настоящее время широко изучаются возможности использования ферментов целлюлолитического комплекса в композиции с амилолитическими и протеолитическим ферментами для комплексной глубокой переработки зернового сырья и вторичных продуктов переработки зерна; получения продуктов повышенной пищевой ценности с заданными технологическими и функциональными свойствами [1—3].

В проведенных ранее исследованиях, посвященных ферментативной модификации тритикалевой муки разных типов с применением ферментных препаратов протеолитического действия, была показана принципиальная возможность получения модифицированных продуктов (белковый гидролизат, структурно-модифицированная тритикалевая мука) с различной степенью и глубиной гидролиза белков, обладающих различными функциональными свойствами [2,4].

Данная работа посвящена изучению эффективности действия ферментных препаратов целлюлолитического и протеолитического действия и мультиэнзимной композиции (МЭК) на их основе при ферментативной модификации продуктов переработки зерна тритикале (отруби).

Материалы и методы исследования. В работе использовали тритикалевые отруби, полученные при переработке зерна тритикале сортов Донслав и Вокализ (урожай 2012 г.) в муку. Данный сорт входит в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию (2015 г.), относится к сортам тритикале, у которых преобладает генотип пшеницы [3].

Содержание растворимого белка определяли методом Лоури, активность протеаз — модифицированным методом Ансона, аминный азот — методом формольного титрования, редуцирующие вещества (РВ) — по методу Бертрана. Фракционирование белков и продуктов протеоли-за определяли методом гелевой хроматографии на колонке с Toyopearlgel HW-55F [5].

В качестве ферментных препаратов протеолитического и целлюлолитического действия использовали: «Нейтраза» — бактериальная металлопротеиназа (Zn), продуцируемая Bacillus amyloliquefaciens; «Дистицим Протацид Экстра» — грибная протеаза, продуцируемая Aspergillus niger, «Шеразим 500L» — очищенная кслиланаза, продуцируемая Aspergillus oryzae и Aspergillus aculeatus; «Вискоферм L» — сбалансированная смесь ксиланазы, (3-глюканазы, целлюлазы и а-амилазы, продуцируемая Aspergillus aculeatus. Все препараты рекомендованы для гидролиза биополимеров зернового сырья [3].

Результаты исследования и их обсуждение. Ферментативная модификация белков растительного сырья, в том числе и белков зерновых культур, представляет собой важный этап в перспективных технологиях глубокой переработки зернового сырья. Известно, что применение ферментных препаратов гемицеллюлазного действия приводит к частичному разрушению гемицеллюлозных цепочек или их переплетений, позволяет упростить внутреннюю структуру биополимеров и способствует диффузионному перемещению молекул белка, тем самым позволяя увеличить степень извлечения белка из муки и пшеничных отрубей [5,6].

Для оценки эффективности действия исследуемых ферментных препаратов ферментативный гидролиз проводили при оптимальных условиях, которые были подобраны экспериментально. Инкубационная смесь состояла из тритикалевых отрубей, воды (гидромодуль 1:10), соответствующего буфера (15% от объема) и ферментного препарата из расчета конечной концентрации соответствующей оптимальной. Отбор проб проводили через каждые 30 мин в течение 2 ч, переносили в центрифужные стаканчики и центрифугировали при 6000 мин-1 в течение 10 мин. Надосадочную жидкость использовали для определения восстанавливающих Сахаров (редуцирующих веществ) по методу Бертрана и количества растворимого белка по методу Лоури.

Эффективность гидролиза оценивали по накоплению редуцирующих веществ (РВ) и растворимого белка. Результаты показаны на рис. 1 и 2.


Таким образом, показана эффективность действия ферментных препаратов целлюлолитического действия на некрахмалистые полисахариды отрубей тритикале. Применение ферментного препарата «Шеразим 500 L» увеличивает количество РВ и растворимого белка в 2 раза; препарата «Вискоферм L» — РВ в 1,5 раза, растворимого белка в 2,5 раза. Полученные данные косвенно свидетельствуют о возможности существенного увеличения пищевой ценности вторичных продуктов переработки зерна тритикале.

В настоящее время с целью интенсификации процесса ферментативного гидролиза применяют комплексную обработку субстрата несколькими ферментными препаратами, так называемыми, мультэнзимными композициями (МЭК) с широким спектром действия.

Исследования проводили с использованием двух муль-тиэнзимных композиций: МЭК-1 («Шеразим» + «Нейтра-за») и МЭК-2 («Вискоферм» + «Дистицим Протацид Экстра»). Выбор ферментных препаратов обусловлен различной специфичностью действия и примерно одинаковыми оптимумами действия: оптимум температуры 50 °С и рН 5,5-6,0 для МЭК-1; 40°С и рН 3,5 дляМЭК-2 [2]. Гидролиз проводили в два этапа. На первом этапе вносили целлюлолитический ферментный препарат, на втором — ферментный препарат протеолитического действия. Время каждого этапа 1,5 ч. Дозировка ферментных препаратов и концентрация субстрата подобраны экспериментально. Далее суспензию центрифугировали при 6000 мшг1 в течение 15 мин.

На колонку, заполненную гелем с Toyopearl gel HW-55 F наносили 5 мл супернатанта. Элюцию проводили дистиллированной водой. Объем собираемых фракций 4 мл. Регистрацию оптической плотности элюата во фракциях осуществляли при длине волны 280 нм.

Профили элюции показаны на рис. 3 и 4. В качестве контроля использовали водную вытяжку из отрубей с гидромодулем 1: 10. Данные по фракционированию продуктов протеолиза методом гелевой хроматографии показывают, что все ана лизируемые образцы характеризуются большим разнообразием белков и продуктов их ферментативного гидролиза под действием МЭК-1 и МЭК-2 с различной молекулярной массой, варьируемой от 700000 до 1000 Дальтон. При этом можно выделить семь основных пиков, которые характерны для белков с определенной молекулярной массой.


В табл. 1 приведены значения молекулярной массы этих белков, пептидов, которые были определены графическим методом с использованием калибровочной кривой. Значительную часть анализируемых белков составляют агломераты белков с молекулярной массой 700000— 350000. При ферментативной модификации их количество снижается примерно в 1,5 и 2,0 раза соответственно для МЭК-1 и МЭК-2.


Фракция с молекулярной массой 100000—50000 Да (IV пик) в образцах с модифицированными белками тритикалевых отрубей полностью отсутствует, хотя в контрольном варианте на ее долю приходится 13,26%. Также в варианте с использованием МЭК-2 отсутствует фракция пептидов с массой 25000 ч 1500 Да (VIпик).

Обращает на себя внимание и резкое снижение количества низкомолекулярных белков и высокомолекулярных пептидов с массой 50000—25000 Да примерно в 2—5 раз, а также средне- и низкомолекулярных пептидов с массой 25000-1500 Да.
Полученные данные свидетельствуют о высокой степени и глубине гидролиза белков тритикалеых отрубей с использованием композиций целлюлолитических и протеолитических ферментов. Так, доля низкомолекулярных азотистых соединений (< 1000) увеличилась в результате ферментативной модификации в 4—5 раз.

Проведенные исследования позволяют сделать следующие выводы.
1.  Показана эффективность действия ферментных препаратов целлюлолитического действия на некрахмалистые полисахариды отрубей тритикале. Применение ферментного препарата «Шеразим 500 L» увеличивает количество РВ и растворимого белка в 2 раза; препарата «Виско-ферм I» — РВ в 1,5 раза, арастворимого белка в 2,5 раза.
2.  Методом гелевой хроматографии изучен фракционный состав продуктов протеолиза белков тритикалевых отрубей с использованием МЭК различного состава.
3.  Выявлены существенные различия в картине элюции и соотношении фракций продуктов протеолиза. Показано, что доля низкомолекулярных азотистых соединений (< 1000) увеличилась в результате ферментативной модификации в 4 раза для МЭК-1 и в 5 раз для МЭК-2. В результате модификации белковых компонентов тритикалевых отрубей с применением ферментных препаратов целлюлолитического и протеолитического действия и МЭК на их основе могут быть получены гидролизаты с определенным профилем пептидов и набором аминокислот, обладающие специфическими свойствами. Они могут быть использованы при производстве широкого спектра продуктов питания общего, функционального и лечебно-профилактического назначения. Это позволит получать продукты различного состава, обладающие определенными технологическими и функциональными свойствами, повысить их пищевую ценность и усвояемость.

Литература
1. Березин, И. В. Исследования в области ферментативного катализа и инженерной энзимологаи/И. В. Березин. — М.: Наука, 1990. - 384 с.
2. Витол, И. С, Ферментативная модификация муки тритикале с использованием протеолитических ферментных препаратов/И. С. Витол, Г. П. Карпиленко // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2015. — №9. — С. 17-22.
3. Витол, И. С. Ферменты и их применение в пищевой промышленности/И. С. Витол, И. Б. Кобелева, С.Е. Траубенберг. — М.: МГУПП. - 2000. - 82 с.
4. Нечаев, А. П. Пищевая химия. Лабораторный практикум/А П. Нечаев [и др.]. - СПб.: ГИОРД. - 2006. - 304 с.
5. Козьмина, Н. П. Биохимия зерна и продуктов его переработки/Н. П. Козьмина. — М.: «Колос» —1976. — 375 с.
6. Колпакова, В. В. Биологическая, пищевая ценность, функциональные свойства и направления использования пшеничных отрубей в пищевых производствах/В. В. Колпакова, А. П. Нечаев, С. М. Севериненко, И. В. Мартьшова // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2000. — № 2. — С. 38—43. 
7. Мелешкина, Е.П. Модификация растительного белка зерна тритикале с помощью биотехнологических методов/Е. П. Мелешкина, И. С. Витол, Г. П. Карпиленко // Хлебопродукты. — 2016. — № 5. — С. 62-64.
 

---