Вискозиметрический метод определения «картофельной» болезни хлеба по разжижающей активности бактериальной A-амилазы
«Картофельная» болезнь хлеба в последние годы достаточно часто встречается в хлебе и представляет серьезную проблему для хлебопеков и мукомолов России вследствие ухудшения качества зернового сырья и нарушения ги-гиены и технологии производства хлеба на малых предприятиях.«Картофельная» болезнь (КБХ) – это бактериальная порча хлеба, которая проявляется в виде специфического неприятного запаха, сопровождающегося ферментным разрушением мякиша, который становится заминающимся, темным и липким вследствие амилолиза крахмала и образования бактериальных внеклеточных слизистых полисахаридов.
Основными возбудителями заболевания является Bacillus subtilis и эпизодически Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis и Bacillus cereus. Помимо перечисленных видов в хлебе с КБХ были также идентифицированы Bacillus clausii и Bacillus firmus (Pepe et al, 2003). Некоторые виды и штаммы считаются патогенными для человека.
Практически все бациллы – возбудители КБХ обладают A-амилазой, синтез которой индуцируется клейстеризованным крахмалом. Для нее характерна высокая разжижающая способность на первом этапе амилолиза крахмала (декстринизация). Связь между КБХ и гидролизом крахмала микробными амилазами была ранее установлена Fisher & Halton (1928), Rosenkvist & Hansen (1995), Pepe et al (2003).
КБХ сокращает период допустимого хранения хлеба, ухудшает его каче-ство и безопасность для потребителей, что приводит к значительным экономическим потерям производителей. Исходя из этого, в России были введены гигиенический норматив для муки пшеничной: мука не допускается на хлебопекарные цели, если пробные лабораторные выпечки из нее приобретают визуальные признаки КБХ через 36 ч хранения во влажных условиях при 37°С. Однако, визуальная оценка признаков довольно субъективна и затруднительна, особенно на начальных этапах порчи, что часто приводит к конфликтным ситуациям.
Задачами настоящего исследования являлись:
- изучение связи КБХ с развитием бацилл и образуемой ими A-амилазы при выпечке и хранении хлеба;
- разработка объективного и быстрого метода обнаружения в хлебе КБХ на основе разжижающей активности бактериальной A-амилазы. Такой метод необходим в мукомольной и хлебопекарной промышленности для обеспечения качества и безопасности зернопродуктов.
Материалы и методы
- Количество спор бацилл в муке, тесте и хлебе проводили в соответствии со стандартом ICC №144. Режим термической обработки исходной сус-пензии и смывов: 80°С, 10 мин.
- Число падения (ЧП) определяли по стандарту ICC №107 и ГОСТ 27676-88 с некоторыми уточнениями. Метод основывался на клейстеризации водной суспензии картофельного крахмала в кипящей водяной бане и последующем измерении разжижения крахмального клейстера бактериальной A-амилазой, экстрагированной из хлеба/теста/муки.
- Определение КБХ проводили визуально в двух формовых хлебах, выпе-ченных согласно ГОСТ 27669-88, после их разрезания. С суточными ин-тервалами в хлебах контролировали внешние проявления КБХ (специфи-ческий запах, изменение цвета мякиша, липкость). Интенсивность КБХ оценивали в баллах.
- Исследовали 26 образцов коммерческой муки из торговой сети и экспе-риментальных образцов, инокулированных штаммами Bacillus subtilis – возбудителями КБХ.
Результаты и обсуждения
А. Вискозиметрический метод определения КБХ
Для контроля КБХ в хлебе во ВНИИЗе был разработан объективный приборный метод, позволяющий точно уловить время возникновения и интенсивность КБХ. Метод основан на вискозиметрическом измерении разжижающей активности бактериальной A-амилазы, образуемой B.subtilis при развитии в хлебе. Схема метода приведена на рис.1.
Для вискозиметрического измерения использовали отечественный при-бор для определения числа падения в зерне и муке (аналог Viscometer Hagberg-Perten). Субстратом A-амилазы в приборных пробирках являлся картофельный крахмал, соответствующий определенным требованиям. В качестве фермента в пробирки вносили 25 мл экстракта мякиша хлеба. По разнице величин числа падения в свежевыпеченном и хранившемся хлебе рассчитывали показатель разжижающей активности (РА) в процентах. Величина РА колеблется в пределах 0-10% в здоровом хлебе. При возникновении КБХ разжижающая активность может нарастать до 96-97%.
В. Связь между величиной РА A-амилазы, количеством бацилл и интенсивностью КБХ в хранящемся хлебе
В целом, 83,3% хлебов, выпеченных из исследованных проб муки, в провокационных условиях в той или иной степени были поражены КБХ, что свидетельствует о широкой встречаемости заболевания. В 33,3% проб заболевание хлеба возникло через 36 ч и менее, в остальных – после более продолжительного хранения (> 36-92 ч). Первая группа была отнесена к пораженным КБХ пробам, вторая группа – к кондиционным (слабо пораженным).Некоторые средние показатели порчи хлеба КБХ в обеих группах проб представлены в таблице 1.
В период ферментации теста и выпечки хлеба происходило некоторое увеличение количества проросших спор, что может быть следствием термоак-тивации дефектных покоящихся спор. Следует отметить, что количество спор бацилл в исходных пробах муки было невысоким и сходным в обеих группах. Существенные различия в интенсивности КБХ между группами (при низких уровня заражения) вероятно связаны с разной физиологической активностью микробных сообществ («медленные» и «быстрые» популяции). Обычно популяции, вызывающие КБХ через 24-36 ч, характеризовались более быстрым ростом и повышенной РА -амилазы в мякише хлеба (рис.2).
Бактериальные популяции отличались между собой также по удельной интенсивности КБХ. Причем популяции в пораженных пробах имели более низкую удельную интенсивность КБХ, чем в кондиционных (рис.3).
Установлена тесная связь между величиной РА и количеством споровых бактерий в хлебе (r = 0,934), а также интенсивностью «картофельной» болезни (r = 0,896). Динамика нарастания РА зависит от скорости размножения популяции споровых бактерий и ее ферментной активности (рис.4).
Заключение
Разработана методика определения РА в хлебе и нормативы РА, характеризующие здоровый и больной хлеб. К преимуществам вискози-метрического метода определения КБХ относятся:- Быстрота и простота приборного выполнения. На всю процедуру требуется около 10-20 мин.
- Объективность и точность определения РА. Расхождения между параллельными определениями в одной буханке не превышают 10%.
- Возможность заблаговременной индикации КБХ и выбраковки больного хлеба за 10-15 ч до визуального обнаружения КБХ.
- Возможность контроля муки и хлеба при их производстве с помощью прибора для определения числа падения, которым обеспечено большинство предприятий.
- Исключение из потребления хлеба с высокими уровнями бактеризации (до 50-100 млн. спор/г), представляющего потенциальный риск для населения, поскольку некоторые виды и штаммы бацилл являются патогенными.
Чтобы оставить комментарий зарегистрируйтесь или войдите на сайт используя свою учетную запись