Протеолитические и целлюлолитические ферментные препараты в глубокой переработке зерна тритикале

В настоящее время широко изучаются возможности использования ферментов целлюлолитического комплекса в композиции с амилолитическими и протеолитическим ферментами для комплексной глубокой переработки зернового сырья и вторичных продуктов переработки зерна; получения продуктов повышенной пищевой ценности с заданными технологическими и функциональными свойствами [1,2,3].

В ранее проведенных в ФГБНУ «ВНИИЗ» исследованиях, посвященных ферментативной модификации тритикалевой муки разных типов с применением ферментных препаратов протеолитического действия бактериального и грибного происхождения была показана принципиальная возможность получения модифицированных продуктов (белковый гидролизат, структурно-модифицированная тритикалевая мука) с различной степенью и глубиной гидролиза белков, обладающих различными функциональными свойствами [2,7]. 

Данная работа посвящена изучению эффективности действия ферментных препаратов целлюлолитического и протеолитического действия и МЭК на их основе при ферментативной модификации продуктов переработки зерна тритикале (отруби).

В работе использовали тритикалевые отруби, полученные при переработке зерна тритикале сорта Донслав и Вокализ (урожай 2012 г.) в муку.

В качестве ферментных препаратов протеолитического и целлюлолитического действия использовали: «Нейтраза» – бактериальная металлопротеиназа (Zn), продуцируемая Bacillus amyloliquefaciens, «Дистицим Протацид Экстра» – грибная протеаза, продуцируемая  Aspergillus niger. «Шеразим 500L» – очищенная кслиланаза, продуцируемая Aspergillus oryzae и Aspergillus aculeatus. «Вискоферм L» – сбалансированная смесь ксиланазы, ?-глюканазы, целлюлазы и ?-амилазы, продуцируемая Aspergillus aculeatus. Все препараты рекомендованы для гидролиза биополимеров зернового сырья [3].

Известно, что применение ферментных препаратов гемицеллюлазного действия приводит к частичному разрушению гемицеллюлозных цепочек или их переплетений, позволяет упростить внутреннюю структуру биополимеров и способствует диффузионному перемещению молекул белка, тем самым позволяет увеличить степень извлечения белка из муки и пшеничных отрубей [4,5].

Для оценки эффективности действия исследуемых ферментных препаратов ферментативный гидролиз проводили при оптимальных условиях, которые были подобраны экспериментально. 
Инкубационная смесь состояла из тритикалевых отрубей, воды (гидромодуль 1:10), соответствующего буфера (15% от объема) и ферментного препарата из расчета конечной концентрации соответствующей оптимальной. Отбор проб проводили через каждые 30 мин в течение 2 часов, переносили в центрифужные стаканчики и центрифугировали при 6000 обмин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость использовали для определения восстанавливающих сахаров (редуцирующих веществ) по методу Бертрана и количества растворимого белка по методу Лоури [8]. 

Эффективность гидролиза оценивали по накоплению РВ и растворимого белка. Результаты представлены на рисунках 1 и 2.


Рисунок 1 – Накопление РВ при гидролизе препаратами Шеразим 500L и Вискоферм L некрахмальных полисахаридов тритикалевых отрубей


Рисунок 2 – Накопление растворимого белка при гидролизе препаратами Шеразим 500L и Вискоферм L некрахмальных полисахаридов тритикалевых отрубей

Таким образом, показана эффективность действия ферментных препаратов целлюлолитического действия на некрахмалистые полисахариды отрубей тритикале. Применение ферментного препарата «Шеразим 500 L» увеличивает количество РВ и растворимого белка в 2 раза; препарата «Вискоферм L» – РВ в 1,5 раза, а растворимого белка в 2,5 раза. Полученные данные косвенно свидетельствуют о возможности существенного увеличения пищевой ценности вторичных продуктов переработки зерна тритикале.

В настоящее время с целью интенсификации процесса ферментативного гидролиза применяют комплексную обработку субстрата несколькими ферментными препаратами, так называемыми, мультэнзимными композициями (МЭК) с широким спектром действия. 

Исследования проводили с использованием двух мультэнзимных композиций: МЭК-1 (Шеразим + Нейтраза) и МЭК-2 (Вискоферм + Дистицим Протацид Экстра). Выбор ферментных препаратов обусловлен различной специфичностью действия и примерно одинаковыми оптимумами действия: оптимум температуры – 50?С;   рН 5,5-6,0 для МЭК-1 и  40?С; рН 3,5 для МЭК-2 [2]. 

Гидролиз проводили в 2-а этапа. На первом этапе вносили целлюлолитический ферментный препарат. На втором этапе – ферментный препарат протеолитического действия. Время каждого этапа 1,5 часа. Дозировка ферментных препаратов и концентрация субстрата подобраны экспериментально.

Далее суспензию центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут. На колонку, заполненную гелем с Toyopearl gel HW-55 F наносили 5 мл супернатанта. Элюцию проводили дистиллированной водой. Объем собираемых фракций – 4 мл. Регистрацию оптической плотности элюата во фракциях осуществляли при длине волны 280 нм. В качестве контроля использовали водный экстракт тритикалевой муки. Профили элюции представлены на рисунке 3. и 4. В качестве контроля использовали водную вытяжку из отрубей – гидромодуль 1 : 10.

 

Рисунок 3 – Фракционирование продуктов протеолиза белков тритикалевых 
Отрубей МЭК-1 методом гель-хроматографии на колонке с Toyopearl gel HW-55F



Рисунок 4 – Фракционирование продуктов протеолиза белков тритикалевых отрубей 
МЭК-2 методом гель-хроматографии на колонке с Toyopearl gel HW-55F

Таблица 1 – Фракционирование продуктов протеолиза белков тритикалевых отрубей 
с использованием МЭК

Фракция	Молекулярная масса, Дальтон	% от общего количества
		Контроль	МЭК-1	МЭК-2
I пик  6 – 13	≥  700000 (выход декстрана синего)	35,81	23,67	19,55
II пик  14 – 15	450000 ÷ 350000	13,26	14,79	12,62
III пик 16 – 19	300000 ÷ 100000	9,95	26,04	3,20
IV пик 20 – 22	100000 ÷ 50000	13,26	0	0
V пик  23 – 26	50000 ÷ 25000	10,08	5,02	1,77
VI пик 27 – 30	25000 ÷ 1500	5,31	2,54	0
VII пик 31 – 36	≤ 1000 Низкомолекулярные азотные соединения (выход тирозина)	12,33	51,06	62,63

Данные по фракционированию продуктов протеолиза методом гель-хроматографии,  представленные на рисунках 3 и 4 показывают, что все анализируемые образцы характеризуются большим разнообразием белков и продуктов их ферментативного гидролиза под действием МЭК-1 и МЭК-2 с различной молекулярной массой, варьируемой от 700000 до 1000 Дальтон. При этом можно выделить семь основных пиков, которые характерны для белков с определенной молекулярной массой. 

В таблице 1 представлены данные по молекулярной массе этих белков, пептидов, которые были определены графическим методом с использованием калибровочной кривой. Значительную часть анализируемых белков составляют агломераты белков с молекулярной  массой 700000 ? 350000.  При ферментативной модификации их количество снижается примерно в 1,5 и 2,0 раза соответственно для МЭК-1 и МЭК-2.

Фракция с молекулярной массой 100000 ? 50000 Да (IV пик) в образцах с модифицированными белками тритикалевых отрубей полностью отсутствует, хотя в контрольном варианте на ее долю приходится 13,26%. Также в варианте с использованием МЭК-2 отсутствует фракция пептидов с массой 25000 ? 1500 Да (VIпик).

Обращает на себя внимание и резкое снижение количества низкомолекулярных белков и высокомолекулярных пептидов с массой 50000 ? 25000 Да примерно в 2 – 5 раз, а также средне- и низкомолекулярных пептидов с массой 25000 ? 1500 Да. 
Полученные данные свидетельствуют о высокой степени и глубине гидролиза белков тритикалеых отрубей с использованием композиций целлюлолитических и протеолитических ферментов. Так, доля низкомолекулярных азотистых соединений (? 1000) увеличилась в результате ферментативной модификации в  4 – 5 раз.

В результате модификации белковых компонентов тритикалевых отрубей с применением ферментных препаратов целлюлолитического и протеолитического действия и МЭК на их основе могут быть получены гидролизаты из вторичных продуктов переработки зернового сырья с определенным профилем пептидов и набором аминокислот, обладающие специфическими свойствами.

Они могут быть использованы при производстве широкого спектра продуктов питания общего, функционального и лечебно-профилактического назначения. Это позволяет получать продукты различного состава, обладающие определенными технологическими и функциональными свойствами, повысить пищевую ценность конечного продукта, улучшить его усвоение.

Ферментативная модификация белков растительного сырья, в том числе и белков зерновых культур, представляет собой важный этап в перспективных технологиях глубокой переработке зернового сырья. 

Литература
1. Березин И.В. Исследования в области ферментативного катализа и инженерной энзимологии. – М.: Наука, 1990. – 384 c.
2. Витол И.С., Карпиленко Г.П. Ферментативная модификация муки тритикале с использованием протеолитических ферментных препаратов // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2015. – № 9. – С. 17-22.
3. Витол И.С., Кобелева И.Б., Траубенберг С.Е. Ферменты и их применение в пищевой промышленности. – М.: МГУПП. – 2000. – 82с.
4. Дарманьян Е.Б.,  Дарманьян П.М. Межмолекулярная ассоциация полисахаридов гемицеллюлоз и растительных белков // Прикладная биохимия и микробиология. - 1995. - № 3. - С. 346-352.
5. Козьмина Н.П. Биохимия зерна и продуктов его переработки. – М.: «Колос» –1976. –375с.
6. Колпакова, В. В., Нечаев А.П., Севериненко С.М., Мартынова И.В. Биологическая, пищевая ценность, функциональные свойства и направления использования пшеничных отрубей в пищевых производствах // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2000. – № 2. – С. 38-43.
7. Мелешкина Е.П., Витол И.С., Карпиленко Г.П. Модификация растительного белка зерна тритикале с помощью биотехнологических методов // Хлебопродукты. – 2016. - № 5. – С. 62-64.
8. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А., Колпакова В.В., Витол И.С., Кобелева И.Б.. Пищевая химия. Лабораторный практикум. – СПб.: ГИОРД. – 2006. – 304 с.
 

---