Утилизация оболочек белого люпина в биотехнологическом производстве

Белый люпин содержит от 32 до 40% сырого протеина, по аминокислотному составу сопоставимого с соевым, превосходя при этом сою по агротехническим показателям. Это способствует широкому возделыванию люпина в России в целях использования продуктов его переработки в комбикормовой и пищевой промышленности [1-3]. В семенах люпина от 10 до 20 — это оболочки, состоящие, главным образом, из трудноусвояемых некрахмальных полисахаридов (НКП), поэтому необходимый первичный этап обработки зерна люпина — их удаление [4, 5].

При промышленной переработке люпина актуальной становится проблема утилизации оболочек. В то же время, оболочки люпина представляют собой возобновляемое растительное сырье, в состав которого входят целлюлоза и гемицеллюлозы, которые могут быть ресурсом для ферментативной конверсии их в простые сахара с последующим превращением в спирты (биотопливо), органические и аминокислоты, биополимеры и другие продукты микробного синтеза [6, 8]. Кроме того, НКП оболочек люпина могут представлять интерес в качестве источника углеводов при проведении микробиологических (ферментационных) процессов, направленных на получение полезных продуктов, например, различных ферментных препаратов.

Цель работы — изучение возможности использования оболочек белого люпина для ферментативной конверсии в сахара, а также в качестве компонента ферментационных сред при культивировании грибных продуцентов технически значимых ферментов.
В качестве субстрата в работе использовали оболочки белого люпина сорта Дега, предоставленные ВНИИ зерна и продуктов его переработки.

Ферментативную конверсию НКП оболочек люпина осуществляли с использованием мультиэнзимной композиции (МЭК), содержащей целлюлазу ксиланазу и целлобиазу ((3-глюкозидазу), полученной на основе штаммов Penicillium verruculosum. Характеристика МЭК представлена в табл. 1.


Предобработку оболочек люпина проводили серной кислотой концентрацией от 0,25 до 1% при температуре от 100 до 140°С в течение от 0,5 до 1 ч. Предобработанную биомассу отделяли центрифугированием, ресуспендировали в 50 мл дистиллированной воды, рН суспензии доводили 1М раствором NaOH до 5,0. Далее биомассу трижды промывали дистиллированной водой.

Ферментативный гидролиз исходных и предобработанных оболочек люпина проводили в термостатируемых объемом 50 мл ячейках при 50 °С, помещенных на качалку (250 колебаний/мин). Концентрация субстрата в реакционной смеси составляла 100 г/л в пересчете на абсолютно сухое вещество (а. с. в.), рН реакционной смеси 5,0 устанавливали 0,1 М Na-ацетатным буфером. МЭК вносили в дозировке 11 мг ферментного препарата (ФП) I на 1 г а. с. в. субстрата. Из реакционной смеси отбирали пробы (по 0,5 мл), центрифугировали (10000 мин-1, 3 мин) и определяли содержание восстанавливающих Сахаров (ВС) методом Шомоди—Нельсона, глюкозы — глюкозооксидазно-пероксидазным методом [8]. Степень конверсии субстрата определяли как выход глюкозы и ВС в пересчете на а. с. в. субстрата.

Активности МЭК по отношению к натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ-азная активность), глюкуроноксилану из березы (ксиланазная активность), n-нитрофенил-?-D-глюкопиранозиду (пНФГ, ?-глюкозидазная активность) производства фирмы Sigma (США) (см. табл. 1) определяли согласно методикам, изложенным в работе [8]: по отношению к КМЦ и ксилану — по начальной скорости образования ВС (50°С; рН 5,0; 0,1М Na-ацетатный буфер), концентрация полисахаридного субстрата в реакционной смеси составляла 5 г/л; по отношению к пНФГ — по начальной скорости образования n-нитрофенола по изменению поглощения на длине волны 400 нм (40°С; рН 5,0; 0,1М Na-ацетатный буфер), концентрация субстрата составляла 0,05 М, реакцию останавливали добавлением 1М раствора Na2CO3. Активность ферментов выражали в международных единицах: 1 единица соответствовала образованию 1 мкмоль продукта за 1 мин при действии ферментов на соответствующий субстрат.
Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури, в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин [9].

Культивирование P. verruculosum 105 (продуцента комплекса целлюлаз) проводили в качалочных колбах с использованием питательной среды следующего состава (г/л): микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) или дробленые оболочки люпина — 40; пшеничные отруби — 10; дрожжевой экстракт — 10; глюкоза — 10; КН2РO4- 15; (NH4)2SO4 - 5; MgSO4 • 7H2O - 0,3; СаСl2 • 2Н2O — 0,3. Культивирование проводили в течение 144 ч в термостатируемой качалке (250 мин-1) при 32°С. После завершения процесса ферментации отбирали пробы культуральной жидкости (КЖ), центрифугировали, в супернатанте определяли концентрацию белка, а также КМЦ-азную, ксиланазную и ?-глюкозидазную активности.
Культивирование P. canescens 25 (продуцента комплекса ксиланазы и сериновой протеазы) проводили в качалочных колбах с использованием питательной среды следующего состава (г/л): дробленые оболочки сои или люпина — 45; кукурузный экстракт — 50; соевая мука — 20; NaH2PО4 — 25. Культивирование проводили в течение 144 ч в термостатируемой качалке (250 мин-1) при 30°С. После завершения процесса ферментации отбирали пробы КЖ, центрифугировали, в супернатанте определяли концентрацию белка, а также протеолитическую активность (ПС) по методу Ансона [10].

Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе исследований был проведен ферментативный гидролиз оболочек люпина с использованием МЭК на основе штаммов P. verruculosum (табл. 2). Через 48 ч ферментативного гидролиза без предварительной обработки глубина конверсии оболочек люпина до ВС и глюкозы в пересчете на концентрацию исходного субстрата (100 г/л по а. с. в.) составила 20 и 11,2%, соответственно, что является недостаточно высоким показателем эффективности процесса.


Следует отметить, что низкая эффективность ферментативного гидролиза не является недостатком, присущим именно оболочкам люпина, — подавляющее большинство видов растительного сырья характеризуется низкой реакционной способностью и для ее увеличения нуждается в предварительной обработке [11].

Предобработка разбавленной кислотой способствовала сповышению степени конверсии оболочек люпина при ферментативном гидролизе. Наиболее глубокому гидролизу способствовала предобработка в условиях: обработка 1%-ным раствором H2SО4, температура 125...140°С, время 1 ч. Степень конверсии в этих условиях составила 63,2—66,8% по выходу ВС и 47,0— 52,2% по глюкозе (см. табл. 2), что свидетельствует о высокой эффективности процесса ферментативного гидролиза.
втором этапе исследований в качестве компонента ферментационных сред при культивировании грибных продуцентов использовали комплексы гидролитических ферментов для гидролиза растительного сырья.

Один из наиболее перспективных продуцентов промышленных целлюлаз и других карбогидраз — мицелиальный гриб P. verruculosum [12]. Штамм P. verruculosum синтезирует внеклеточный комплекс эндоглюканаз, целлобиогидролаз, ксиланаз и р?-глюкозидаз, которые эффективно расщепляют целлюлозосодержащее сырье; кроме того, индивидуальные ферменты P. verruculosum обладают высокой удельной активностью и операционной стабильностью [13]. Это стало основанием для использования МЭК, полученной на основе штаммов P. verruculosum на предыдущем этапе работы, в процессе ферментативной конверсии оболочек люпина. Представлялось целесообразным проверить возможность использования оболочек люпина в качестве одного из основных компонентов ферментационных сред для культивирования P. verruculosum, синтезирующего комплекс ферментов, которые далее можно использовать для биоконверсии этих же оболочек, а также других видов возобновляемого растительного сырья.

В связи с этим оболочки люпина (без предобработки серной кислотой) использовали для замены МКЦ — наиболее важного и дорогостоящего компонента питательной среды, являющегося индуктором биосинтеза секреторных ферментов P. verruculosum [14]. Культивирование P. verruculosum 105 проводили в качалочных колбах, используя в качестве основного источника углерода МКЦ (контроль), оболочки люпина и их смеси в различном соотношении. Результаты определения в КЖ по целлюлазной (КМЦ-азной), ксиланазной и (?-глюкозидазной активности, а также концентрации белка (рис. 1).


Результаты показали, что замена МКЦ на оболочки люпина не приводит к заметному снижению активности основных ферментов комплекса карбогидраз, следовательно, оболочки люпина могут быть использованы в качестве основного компонента ферментационной среды вместо МКЦ при проведении ферментации P. verruculosum 105 в качалочных колбах. Частичная замена МКЦ на оболочки люпина (25%) способствовала увеличению активности КМЦ-азы и ксиланазы на 12 и 21%, соответственно.

При переработке белоксодержащего сырья в пищевой и кормовой промышленности наиболее эффективны комплексные ферментные препараты, содержащие карбогидразы и протеазы [15, 16]. На основе штамма P. canescens, успешно используемого в качестве штамма-хозяина для экспрессии различных гомологичных и гетерологичных генов с целью получения промышлен-но значимых ФП (ксиланаз, пектиназ, арабиназ, инулиназ, ?- и ?-галактозидаз, фитазы, протеаз и т.д.) [17], ранее был создан продуцент комплексного препарата ксиланазы и сериновой протеазы для применения в кормопроизводстве — штамм P. canescens 25. Была проверена возможность использования оболочек люпина в качестве одного из основных субстратов при культивировании нового штамма.

В питательной среде для биосинтеза сериновой протеазы P. canescens оболочки люпина использовали для полной или частичной замены оболочек сои, являющихся источником углеводов и индуктором биосинтеза ферментов штаммом. Результаты определения ксиланазной и протеолитической активности в КЖ, а также концентрации белка приведены на рис. 2.


Введение в ферментационную среду для культивирования P. canescens 25 оболочек люпина вместо соевых не оказало влияния на уровень биосинтеза сериновой протеазы штаммом и способствовало увеличению ксиланазной активности продуцента на 10%. Результаты, полученные при культивировании штамма P. canescens 25, могут быть использованы для других рекомбинантных штаммов, полученных на основе P. Canescens, — продуцентов различных технических значимых ферментов.

Выводы. В результате проведенных исследований было показано, что оболочки люпина после предобработки разбавленной кислотой можно рассматривать как привлекательное возобновляемое сырье для биоконверсии в простые сахара. Оболочки люпина могут быть использованы в качестве основного компонента ферментационных сред для биосинтеза штаммом P. verruculosum комплекса внеклеточных карбогидраз (целлюлаз и гемицеллюлаз), которые далее можно применять для биоконверсии возобновляемого растительного сырья, в том числе оболочек люпина. Введение оболочек люпина в ферментационную среду для культивирования штамма P. canescens 25 обеспечило высокий уровень активности основных компонентов его ферментативного комплекса — ксиланазы и сериновой протеазы.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», проект № RFMEFI61614X0002.


Литература
1.  Цыгуткин, А. С. Белый люпин как сельскохозяйственная культура / А. С. Цыгуткин, С. В. Зверев // Хранение и переработка зерна. — 2014. — №4. — С. 20—23.
2.  Штеле, А. Л. Кормовая ценность белого люпина для высокопродуктивной птицы / А. Л. Штеле // Белый люпин. - 2014. - № 1. - С. 15-21.
3.   Штеле, А. Л. Использование нового белкового продукта из белого люпина в кормлении перепелов / А. О. Штеле, B. А. Терехов // Белый люпин. — 2014. — №2. — C.  16-21.
4.   Перов, А. А. Шелушение и фракционирование узколистного люпина / А. А. Перов, С. В. Зверев // Комбикорма. - 2014. - № 2. - С. 43-44.
5.  Артюхов, А. И., Подобедов А. В. Современные направления исследований по люпину / А. И. Артюхов, А. В. Подобедов // Зернобобовые и крупяные культуры. — 2012. — №1.-С. 80-86.
6.   E4tech, RE-CORD and WUR (2015) «From the sugar platform to biofuels and biochemicals». Final report for the Europian Comission, contract No. ENER/C2/423— 2012/SI2.673791.
7.   Mohamed, A., Rayas-Duarte, P. Non-starchy polysaccharide analysis of cotyledon and hull of Lupinus albus / Cereal Chem. - 1995. - V. 72 (6). - P. 648-651.
8.   Синицын, А. П. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов / А. П. Синицын, А. В. Гусаков, В. М. Черноглазое. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.
9.  Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. — М.: Мир, 1991. — 464 с.
10. Полыгалина, Г. В. Определение активности ферментов / Г.В. Полыгалина, B.C. Чередниченко, Л.В. Римарева. Справочник. — М.: ДеЛи принт, 2003. — 375 с.
11. Доценко, Г. С. Реакционная способность различных цел-люлозосодержащих материалов при ферментативном гидролизе / Г. С. Доценко [и др.] // Лесной вестник. — 2012.-Т. 8.-№91.-С. 129-134.
12..Osipov D.O., Rozhkova A.M., Matys V. Yu, Koshelev A. V., Okunev O. N., Rubtsova E.A., Pravilnikov A. G., Zorov I. N., Oveshnikov I.N., Davidov E.R., Sinitsyna O.A., Sinit-synA.P. Production of Byocatalysts on the Basis of Recombinant Heterologous Xylanase Producer Strains in the Penicil-lium verruculosum Fungus: Their Application in the Hydrolysis of Timber and Wood Processing Industry Wastes / CATALYSIS IN INDUSTRY. - 2011. - V. 3. - No 1. -P. 34-40.
13.Castellanos O.F., Sinitsyn A. P., Vlasenko E. Yu. Comparative evaluation of hydrolytic efficiency toward microcrystalline cellulose of Penicillium and Trichoderma cellulases // Biore-source Technology. - 1995. - V. 52 (2). - P. 119-124.
14. GusakovA. V., Sinitsyn A. P. Cellulases from Penicillium species for producing fuels from biomass // Biofuels. — 2012. — No. 3 (4). - P. 463-477.
15. Bedford M. R. Enzymes in farm animal nutrition / M. R. Bedford, G.G. Partridge. UK: CAB International, 2010. — 319 p.
16.Melim Miguel, A., Souza, Т., Costa Figueiredo, E., Paulo Lobo, В., Maria, G. Enzymes in Bakery: Current and Future Trends. In Food Industry / Ed. Dr. Innocenzo Muzzalupo. 2013.
17. Sinitsyn A. P., Rozhkova A. M. Penicillium canescens host as the platform for development of a new recombinant strains producers of carbohydrases: Microorganisms in Biorefineries [Ed.B. Kamm] — Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, 2015. - P. 1-20.

 

---