Модификация растительного белка зерна тритикале с применением битехнологических методов

Биотехнологические методы воздействия на растительный белок позволяют получать продукты различного состава, обладающие определёнными технологическими и функциональными свойствами. Они могут быть использованы при производстве широкого спектра продуктов питания общего, функционального и лечебно-профилактического назначения [3, 6, 7].

В зависимости от способа получения, белковые гидролизаты делят на 3 основные группы:

• щелочные - поскольку при таком гидролизе образуются остатки лан-тионина и лизиноаланина, которые токсичны для организма человека и животных, то для получения гидролизатов этот способ практически не используют;
• кислотные - получают при гидролизе главным образом соляной кислотой. Основоположником их производства в конце XIX в. был швейцарский мельник Ю. Магги;
• ферментативные - вырабатываются ферментацией муки и других продуктов переработки зерна различными ферментными препаратами либо их комплексом. Ферментативный гидролиз растительного сырья наиболее предпочтителен.

Установлено, что для применения белковых гидролизатов необязательно получать их с высокой глубиной гидролиза, так как пептиды также хорошо усваиваются организмом [7].

Гидролизаты белков делят на две большие группы: частично гидро-лизованные и полностью гидролизованные. Каждый из гидролизатов обладает определёнными свойствами, которые обуславливают область их применения. Полностью гидролизованные белки обладают низкой антигенной активностью, что позволяет использовать их в гипоаллергенных детских диетах. Такие гидролизаты содержат свободные аминокислоты и короткие пептиды. Частично гидролизованные белки включают в себя широкий спектр продуктов гидролиза. В их состав входят: фракция свободных аминокислот и коротких пептидов; достаточно большое количество олиго-пептидов; существенное количество высокомолекулярных продуктов гидролиза. Их характеризуют как слабо- и среднегидролизованные белки. Гидролизаты, относящиеся к этой группе, существенно не различаются между собой. Их используют в качестве легкоусвояемого источника аминного азота в специализированных диетах [3, 6].

Биотехнологические приёмы воздействия на биополимеры зерна тритикале практически не изучены. В то же время метод ферментативной модификации растительного белка позволяет получать продукты протеолиза различного состава с определёнными технологическими и функциональными свойствами, которые в качестве компонентов могут быть использованы в составе продуктов общего и специального назначения.

В связи с этим были исследованы цельносмолотая тритикалевая мука и два образца, сформированные на основе кумулятивных кривых зольности: Т-800, полученный смешиванием трёх основных потоков муки,которые характеризуются различным составом анатомических частей зерновки, и Т-700, включающий преимущественно фракцию эндосперма [5].

В качестве ферментных препаратов протеолитического действия - протеаз бактериального происхождения в работе использовали препараты фирмы «Новозаймс»: «Нейтраза» - бактериальная металлопротеиназа (Zn), продуцируемая Bacillus amyloliquefaciens; «Алкалаза FG» - бактериальная протеиназа, продуцируемая Bacillus licheniformis. Основной ферментный компонент субтилизин Калсберга относится к сериновым протеиназам. В качестве препаратов протеаз грибного происхождения был использован препарат «Протеаза GC-106» фирмы «Дженненкор» - грибная протеаза, продуцируемая Aspergillus oryzae. Все препараты рекомендованы для гидролиза белков зернового сырья [1].

Для оценки молекулярной массы [единица измерения - дальтон (Да)] продуктов протеолиза использовали метод гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-75, которая была предварительно откалибрована метчиками - белками с известной молекулярной массой [4].

Ферментативную модификацию тритикалевой муки ферментными препаратами протеолитического действия и МЭК на их основе проводили в трёх вариантах при оптимальных условиях, которые подбирали экспериментально [1].

 Вариант 1. Для оценки эффективности действия препаратов протеаз и характеристики продуктов протеолиза ферментативный гидролиз цельносмолотой тритикалевой муки под действием препаратов «Нейтраза» и «Протеаза GC-106» проводили в течение 2 ч. Далее суспензию центрифугировали при частоте вращения 6000 мин-1 в течение 15 мин. На колонку, заполненную гелем сефа-декса G-75, наносили 5 мл супернатанта. Элюцию проводили дистиллированной водой. Объём собираемых фракций - 4 мл. Оптическую плотность элюата во фракциях регистрировали при длине волны 280 нм (А280). В качестве контроля использовали водный экстракт тритикалевой муки.

Сравнительный анализ профилей элюции, представленных на рис. 1, а, и данных табл. 1 показывает, что внесение препаратов бактериальных и грибных протеаз не только изменяет соотношение высоко-, средне- и низкомолекулярных продуктов протеолиза, но и во многом изменяет картину элюции: характер распределения продуктов протеолиза, образовавшихся в результате применения разных препаратов, по фракциям совершенно различен. Так, при ферментативном гидролизе белков тритикалевой муки препаратом «Нейтраза» наблюдается снижение высокомолекулярной фракции (с молекулярной массой более 70000 Да) на 29,79%, тогда как при действии препарата «Протеаза GC-106» - на 56,58%. Прирост низкомолекулярной фракции (с молекулярной массой менее 3000 Да) составляет соответственно 16,51 и 35,21%.

При использовании «Нейтразы» образуется примерно в 3 раза больше среднемолекулярных пептидов с молекулярной массой от 30000 до 20000 Да, по сравнению с «Протеазой GC-106». В свою очередь, при действии «Протеазы GC-106» количество низкомолекулярных пептидов (молекулярная масса 20000-10000 Да) примерно в 2,5 раза выше, чем при действии «Нейтразы».

Вариант 2. Аналогичные исследования были проведены с образцом муки Т-800.
Анализ профилей элюции на рис. 1, б и данных табл. 1 показал, что характер распределения продуктов протеолиза по фракциям (в зависимости от молекулярной массы) практически совпадает с фракционированием продуктов протеолиза белков цельносмолотого зерна (см. рис. 1, а). Отличие состоит в том, что в образце муки Т-800 происходит более существенное снижение высокомолекулярной фракции (> 70000 Да) и одновременно увеличиваются фракции низкомолекулярных продуктов протеолиза (< 3000 Да) при использовании как бактериальной, так и грибной протеазы. Это, возможно, объясняется большей доступностью субстрата и отсутствием ингибирующего воздействия на ферменты со стороны компонентов периферийных частей зерновки, присутствующих в цельносмолотом зерне в значительно больших количествах.

Вариант 3. На заключительном этапе проводили ферментативную модификацию тритикалевой муки, включающей преимущественно фракцию эндосперма, - образец Т-700 с использованием МЭК из ферментных препаратов протеаз бактериального и грибного происхождения в целях получения продуктов глубокого гидролиза белков. В состав МЭК входили 3 ферментных препарата протеолитического действия: «Нейтраза», «Алкалаза» и «Протеаза GC-106». Выбор ферментных препаратов обусловлен различной специфичностью воздействия на белки и примерно одинаковыми оптимальными параметрами:температура 50°С; рН 5,5-6 [1]. Гидролиз проводили в 2 этапа. На первом этапе вносили бактериальные протеазы «Ней-тразу» и «Алкалазу», на втором этапе - грибную «Протеазу GC-106». Продолжительность каждого этапа -2 ч. Дозировка ферментных препаратов и концентрация субстрата подобраны экспериментально и аналогичны предыдущим исследованиям [1]. Результаты фракционирования продуктов протеолиза белков тритикалевой муки(образец Т-700)приведены на рис. 2 и в табл. 2.

Анализ полученных в этом варианте данных свидетельствует о том, что применение МЭК, в состав которой входят протеолитические ферменты с разной специфичностью действия, принципиально изменило картину элюции белков и позволило практически полностью гидролизовать белки, в том числе, возможно, и высокомолекулярные продукты протеолиза клейковинных белков, которые частично переходят в раствор [2]. Так, высокомолекулярная фракция с молекулярной массой более 70000 Да и фракция с молекулярной массой 40000-30000 Да практически отсутствуют, при этом в гидролизате количество низкомолекулярных пептидов и аминокислот увеличилось примерно в 2,5-3 раза, по сравнению с контролем.

На основании экспериментальных данных гидролизат, полученный с использованием МЭК на основе ферментных препаратов протеаз, можно позиционировать как возможный компонент гипоаллергенных и безглютеновых мучных изделий лечебно-профилактического назначения.

Ферментативная модификация белков растительного сырья, в том числе и белков зерновых культур, представляет собой важный этап в перспективных технологиях глубокой переработки зернового сырья. В результате модификации белковых компонентов зерна и муки с применением ферментных препаратов протеолитического действия и МЭК на их основе могут быть получены продукты гидролиза с определённым профилем пептидов и набором аминокислот, обладающие специфическими свойствами.

Литература
1. Витол, И. С. Ферментативная модификация муки тритикале с использованием протеолити-ческих ферментных препаратов / И.С. Витол, Г.П. Карпиленко//Хранение и переработка сельхозсырья. -2015. - №9.-С. 17-22.
2. Казьмина, Н. П. Биохимия зерна и продуктов его переработки/Н.П. Козьмина. - М.: Колос, 1976.-375 с.
3. Нечаев, А. П. Пищевая химия / А.П. Нечаев [и др.]. - С.-Пб.: ГИОРД, 2015.-672 с.
4. Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот/ Л.А. Остерман. - М.: Наука, 1985. -536 с.
5. Панкратов, Г.Н. Технологические свойства новых сортов тритикалевой муки/Г. Н. Панкратов [и др.] // Хлебопродукты. - 2016. - № 1. -С. 60-62.
6. Румянцева, Г.Н. Влияние ферментных препаратов протеолитического действия на белоксодержащее сырьё / Г.Н. Румянцева, М.Н. Евсеичева // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2005. - №2. - С. 48.
7. Телишевская, Л. Я. Белковые гидролизаты и их применение / Л.Я. Телишевская/Аграрная наука. -2000.-№12.-С. 20-21. 
 

 

---