Модификация муки тритикале с использованием протеолитических ферментных препаратов

Последние тенденции в развитии перерабатывающих отраслей пищевой индустрии связаны с созданием безотходных технологий и технологий глубокой переработки сырья, в том числе растительного. В настоящее время растительный белок достаточно широко используется для приготовления высокобелковых пищевых продуктов, однако это относится преимущественно к соевому белку. Белки других культур, в том числе и белки зерна тритикале, а также продукты их ферментативной модификации пока не изучены. В то же время биотехнологические методы воздействия на растительный белок позволяют получать продукты различного состава, обладающие определенными технологическими и функциональными свойствами. Они могут быть использованы при производстве широкого спектра продуктов питания общего, функционального и лечебно-профилактического назначения.

Как известно, тритикале — зерновая культура, созданная человеком путем гибридизации пшеницы и ржи. Свое название культура получила в 1931 году от комбинации латинских названий исходных родов: triticum — пшеница и secale — рожь [1, 2]. В Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в России, на 2015 г. внесено 65 сортов озимого и 11 сортов ярового тритикале, которые районированы практически во всех регионах Российской Федерации [3].

Если до недавнего времени культура тритикале чаще всего воспринималась как культура кормового и фуражного использования, то в настоящее время она находит все большее применение в хлебопекарной и кондитерской промышленности, в пивоварении, при производстве спирта и алкогольных напитков [2,4].

Цель исследований: изучение кинетики действия ферментных препаратов протеаз на тритикалевую муку; проведение ферментативной модификации три-тикалевой муки с использованием протеолитических ферментных препаратов бактериального и грибного происхождения; оценка продуктов протеолиза методом гель-хроматографии.

Материалы и методы исследований. Использовали зерно озимого тритикале сорта Донслав, выращенное в Ростовской области, урожая 2012—2013 гг., предоставленное Донским зональным НИИ сельского хозяйства. Данный сорт входит в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию, относится к сортам тритикале, у которых преобладает генотип пшеницы [3].
Содержание растворимого белка определяли методом Лоури, активность протеаз — модифицированным методом Ансона. В качестве стандартного субстрата использовали 0,5%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, зернового субстрата — измельченное зерно тритикале, характеризующееся 100%-ным проходом через сито d = 1 мм, смешанное с водой в соотношении помол: вода 1:4. Аминный азот определяли методом формольного титрования; фракционирование белков и продуктов протеолиза — методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-75.

В качестве препаратов протеаз бактериального происхождения в работе использовались следующие препараты фирмы «Новозаймс»: Нейтраза — бактериальная металлопротеиназа (Zn), продуцируемая Bacillus amyloliquefaciens, Алкалаза FG — бактериальная про-теиназа, продуцируемая Bacillus licheniformis. Основной ферментный компонент Субтилизин Калсберга относится к сериновым протеиназам. В качестве препаратов протеаз грибного происхождения использовали препараты фирмы «Дёлер» и «Дженненкор» соответственно: Дистицим Протацид Экстра — грибная протеаза, продуцируемая Aspergillus niger, и Протеаза GC-106 — грибная протеаза, продуцируемая Aspergillus oryzae. Все препараты рекомендованы для гидролиза белков зернового сырья.

Результаты исследований и их обсуждение. Ферментативная модификация белков растительного сырья, в том числе и белков зерновых культур, представляет собой важный этап в перспективных технологиях глубокой переработке зернового сырья. В результате модификации белковых компонентов зерна и муки с применением ферментных препаратов протеолитического действия могут быть получены продукты гидролиза с определенным профилем пептидов и набором аминокислот, обладающие специфическими свойствами [5, 6].

При традиционной характеристике ферментных препаратов выявление оптимума температуры и рН, как и других кинетических параметров, проводят с использованием стандартного субстрата. Вместе с тем, в промышленных условиях, в условиях конкретной технологии пищевого производства в качестве такого субстрата выступает сложная гетерогенная система, что приводит к изменению основных кинетических параметров ферментативной реакции. Состав зерно-вого субстрата может оказывать влияние на характер протекания процесса протеолиза и изменить оптимальные значения температуры и рН. Так, при изучении влияния рН на активность исследуемых препаратов бактериального происхождения установлено, что оптимум рН при гидролизе белков зернового субстрата для препаратов Нейтраза и Алкалаза сдвигается в кислую область относительно стандартного субстрата и составляет 5,5—6,0 и 6,0—6,5 соответственно. При рН 5,0 препарат Нейтраза сохраняет только около 45%, в то время как Алкалаза — 70% активности (рис. 1).

При исследовании влияния температуры на активность ферментных препаратов установлено, что температурный оптимум для Нейтразы при действии на стандартный субстрат составляет 40 °С и сдвигается в область более высоких температур при действии на зерновой субстрат (50 °С). Причем, при 60 °С в этом случае сохраняется 90% активности, а при 70 "С — 40%, тогда как при действии на стандартный субстрат фермент теряет свою активность практически полностью.

Температурный оптимум для Алкалазы при гидролизе стандартного субстрата составляет 60 °С, при 70 °С активность этого ферментного препарата снижается на 80%. При протеолизе белков зернового сырья температурный оптимум для «Алкалазы» смещается в сторону более низких температур — 40. ..50 °С (рис. 2).

При исследовании влияния рН на активность ферментных препаратов грибного происхождения следует отметить, что Дистицим Протацид Экстра проявляет активность в кислой зоне рН, причем на стандартном субстрате оптимум рН 3,0; на зерновом субстрате 3,5 (рис. 3).

Протеаза GC-106 проявляет максимальную активность при гидролизе стандартного субстрата при рН 5,0; а при гидролизе зернового субстрата при рН 5,5—6,0.
При исследовании влияния температуры на активность этих ферментных препаратов установлено, что температурный оптимум для препарата Дистицима Протацид Экстра при действии на оба субстрата составляет 60 °С, а для Протеазы GC-106 — 50 °С.
Из графика видно, что первый препарат сохраняет большую часть своей активности при повышении температуры также при действии на оба субстрата (60—70% при 70 °С и 50-55% при 80 °С). Активность Протеазы GC-106 при 70 °С снижается до 20 и 30% для стандартного и зернового субстрата соответственно (рис. 4).

Гидролиз тритикалевой муки бактериальной протеазой — препаратом Нейтраза — проводили при температуре 50 "С и рН 5,5 с концентрацией субстрата 100мг/мл в течение 30 мин. Ранее было установлено, что в течение 30 мин реакция идет по 0-порядку. Ферментный препарат Нейтраза вносили в количестве от 0,25 до 1,5 ед. ПС/г муки.

Зависимость начальной скорости реакции (VQ) от концентрации вносимого препарата представлена на рис. 5.


Известно, что начальная скорость ферментативной реакции является мерой количества фермента, поскольку значение К0 прямо пропорционально количеству внесенного фермента. Однако при действии ферментного препарата, а не высокоочищенного фермента на сложный гетерогенный субстрат, возможны отклонения от классической зависимости, которые, в свою очередь, связаны с различного рода факторами (например, ингибирующим действием отдельных компонентов зернового субстрата).
В результате проведенных исследований установлено, что концентрация 0,5 ед. ПС/г муки является оптимальной при действии ферментного препарата Нейтраза на белок тритикалевой муки.

Для выбора оптимальной концентрации субстрата гидролиз тритикалевой муки проводили при оптимальных условиях: рН 5,0—6,0, температура 50 "С, время 30 мин. Концентрацию субстрата изменяли от 20 до 120 мг/мл. Ферментный препарат Нейтраза вносили в оптимальных концентрациях.

По полученным данным строили кинетические кривые и рассчитывали средние значения начальных скоростей ферментативных реакций при различных концентрациях субстрата (рис. 6).

Анализ представленных данных показывает, что при концентрации субстрата выше 100мг/мл начальная скорость ферментативной реакции К0 не изменяется (субстратная кривая выходит на плато). Это указывает на то, что концентрация субстрата 100мг/мл является насыщающей, а скорость ферментативной реакции — максимальной. Таким образом, установлено, что максимальная скорость гидролиза наблюдается при концентрации ферментного препарата Нейтраза 0,5 ед. ПС/г муки и концентрации субстрата 100мг/мл.

Аналогичные исследования были проведены с использованием препарата — Протеаза GC-106. Гидролизтритикалевой муки проводили при рН 5,5 и температуре 50 "С, при концентрации субстрата 100мг/мл в течение 30 мин. Ферментный препарат Протеаза GC-106 — вносили в количествах от в количестве 0,25—1,5 мг/мл. На рис. 7  показана зависимость начальной скорости реакции от дозировки ферментного препарата.

В результате проведенных исследований установлено, что концентрация 0,75 ед. ПС/г муки является оптимальной при действии ферментного препарата Протеаза GC-106 на белок тритикалевой муки.
Для выбора оптимальной концентрации субстрата гидролиз тритикалевой муки проводили при оптимальных условиях: рН 5,0—6,0, температура 50 "С, время 30 мин. Концентрацию субстрата изменяли от 20 до 120 мг/мл. Ферментный препарат Протеаза GC-106 вносили в оптимальных концентрациях. Строили кинетические кривые и рассчитывали средние значения начальных скоростей ферментативных реакций при различных концентрациях субстрата (рис. 8).

Анализ полученных данных показывает, что максимальная скорость гидролиза наблюдается при концентрации ферментного препарата Протеаза GC-106 0,75 ед. ПС/г муки и насыщающей концентрации субстрата 80 мг/мл.

Для оценки эффективности действия препаратов протеаз и характеристики продуктов протеолиза ферментативный гидролиз тритикалевой муки под действием препаратов Нейтраза и Протеаза GC-106 проводили в течение 2 ч при оптимальных условиях. Далее суспензию центрифугировали при 6000 мин-1 в течение 15 мин. На колонку, заполненную гелем сефадек-са G-75 наносили 5 мл супернатанта. Элюпию проводили дистиллированной водой. Объем собираемых фракций — 4 мл. Регистрацию оптической плотности элюата во фракциях осуществляли при длине волны 280 нм. В качестве контроля использовали водный экстракт тритикалевой муки, полученный при соотношении мука: вода 1:20.
Профили элюции представлены на рис. 9.

В таблице приведены данные по молекулярной массе, образовавшихся продуктов протеолиза белков тритикалевой муки при внесении препаратов бактериальной и грибной протеаз и процентное соотношение различных фракций.

Сравнительный анализ профилей элюции, представленных на рис. 9, и данных таблицы показывает, что внесение препаратов бактериальных и грибных протеаз не только изменяет соотношение высоко-, средне- и низкомолекулярных продуктов протеолиза, но и во многом изменяет картину элюции: характер распределения продуктов протеолиза, образовавшихся в результате применения разных препаратов, по фракциям совершенно различен.

Так, при ферментативном гидролизе белков тритикалевой муки препаратом Нейтраза наблюдается снижение высокомолекулярной фракции (с молекулярной массой более 70000 Да) на 29,79%, а при действии препарата Протеаза GC-106 — на 56,58%. Прирост низкомолекулярной фракции (менее 3000 Да) составляет 16,51% для Нейтразы и 35,21% для Протеазы GC-106.


При использовании Нейтразы образуется примерно в 3 раза больше среднемолекулярных пептидов с молекулярной массой от 30000 до 20000 Да по сравнению с Протеазой GC-106; в свою очередь, при действии Протеазы GC-106 количество низкомолекулярных пептидов (20000—10000 Да) примерно в 2,5 раза выше, при действии Нейтразы.

 Выводы 
1. Выявлено отличие в действии микробных ферментных препаратов протеаз бактериального и грибного происхождения на стандартный и зерновой субстраты.
2. Определены основные кинетические характеристики ферментативного гидролиза тритикалевой муки препаратами Нейтраза и Протеаза GC-106.
3. Методом гель-хроматографии изучен фракционный состав продуктов протеолиза белков тритикалевой муки. Показано, что максимальное образование низкомолекулярных продуктов гидролиза белков (аминокислоты и пептиды) происходит при использовании ферментного препарата Протеаза GC-106, в то время как ферментативный гидролиз под действием препарата Нейтраза приводит к накоплению высоко- и среднемолекулярных пептидов.

Литература:
1. Тритикале — первая зерновая культура, созданная человеком: Пер. с англ. — М.: Колос, 1978. — 285 с.
2. Мелешкина, Е. П. Оценка качества зерна тритикале / Е. П. Мелешкина [и др.] // Хлебопродукты. — 2015. — №2. — С. 48-49.
3. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в России. — 2015. — С. 17—18.
4. Кандроков, Р. X. Влияние ГТО на выход и качество тритикалевой муки/Р. X. Кандроков, А.А. Стариченков, Т.С. Штейнберг // Хлебопродукты. — 2015. — № 1. — С. 64.
5. Румянцева, Г. Н. Влияние ферментных препаратов проте-олитического действия на белоксодержащее сырье/ Г. Н. Румянцева, М. Н Евсеичева // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2005. —№2. — С. 48. 
6. Витол, И. С. Ферменты и их применение в пищевой промышленности/И. С. Витол, И. Б. Кобелева, С. Е. Траубен-берг. - М.: ИК МГУПП. - 2000. - 82 с.
 
Канд. биол. наук  И, С. ВИТОЛ; д-р техн. наук, профессор Г. П. КАРПИЛЕНКО 

Статья опубликована в журнале:
Хранение и переработка сельхозсырья. – 2015. - №9- С.17-22.

 

 
Наверх ↑