Новый метод определения – новые аспекты картофельной болезни хлеба
К числу одних из наиболее распространенных факторов риска для здоровья человека при употреблении продуктов из пшеничной муки относится бактериальная порча, вызываемая спорообразующими бактериями рода Bacillus, – так называемая картофельная болезнь хлеба (КБХ). Болезнь сопровождается ухудшением товарных свойств, качества, пищевой ценности хлеба, и главное - угрозой безопасности для потребителей.
Согласно Техническому регламенту Таможенного союза 021/2011 «О безопасности пищевой продукции», СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» и Дополнениям и изменениям № 2 к нему для муки пшеничной, используемой для выпечки хлеба, не допускается зараженность хлеба возбудителями картофельной болезни, определяемая в соответствии с Инструкцией [1].
Общепризнанный метод определения картофельной болезни основан на проведении в лабораторных условиях пробной выпечки хлеба с последующем его инкубированием при 38°С в течение 36 ч. Оценка проявлений картофельной болезни в хлебе – органолептическая. Продолжительность метода составляет несколько суток, т.к. требуются проведение пробной выпечки и инкубирование выпеченного хлеба в течение 36-и ч.
Известно, что основные проявления картофельной болезни: липкость и заминаемость мякиша, образование в нем слизистых нитей обусловлены гидролизом ?-амилазы СБГКП крахмала хлеба, вследствие чего образуются низкомолекулярные декстрины и сахара. Другими словами, признаки картофельной болезни хлеба обусловлены разжижающей активностью ?-амилазы (РА) спорообразующих бактерий группы картофельной палочки (СБГКП). Одним из способов оценки разжижающей активности ?-амилазы микроорганизмов и зерна является вискозиметрический [2, 3]. Создание этого метода, а также возможность его применения обусловлены тем, что ферменты амилолитического действия, и прежде всего, ?-амилаза зерна и муки, не могут препятствовать определению бактериальных ферментов того же действия, т.к. активность первых в здоровом зерне ничтожна, и даже в проросшем – в 25-100 раз слабее, чем ?-амилаза споровых бактериях [4];
В ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт зерна и продуктов его переработки» (далее ВНИИЗ) разработаны вискозиметрические методы определения зараженности картофельной болезнью как зерна, так и хлеба [5, 6] зараженности пшеницы картофельной болезнью для производственных предприятий уже на этапе зерна.
По сравнению с другими методами вискозиметрическое определение КБХ имеет следующие преимущества:
* достоверность и объективность метода в отличие от органолептической оценки,
* большая чувствительность метода и вследствие этого возможность обнаруживать КБХ в более ранние сроки;
* обеспеченность метода отечественным серийно выпускаемым прибором ПЧП-3, которым оснащено большинство мукомольных и хлебопекарных предприятий.
В связи с разработкой новых методов оценки картофельной болезни появилась возможность исследовать и оценить по-новому процессы порчи хлеба, в том числе сравнить процессы порчи хлеба зараженного возбудителями картофельной болезни в разной степени.
Исследования проведены на 8-и пробах пшеничной муки высшего сорта, выработанных мельничными комбинатами по ГОСТ Р 52189-2003 «Мука пшеничная. Общие технические условия». В качестве контрольного метода применен общепринятый с проведением пробных лабораторных выпечек хлеба и его последующим хранением при 38°С, но значительно более продолжительное время - в течение 60-и - 90 ч. При этом наличие и развитие КБХ определяли по интенсивности специфического запаха, липкости и цвету мякиша, появлению очагов и оценивали органолептически по 5-балльной шкале через определенные промежутки времени – от 12 до 30 ч – через 24, 36 ,48, 60 и 90 ч. Помимо органолептической оценки в пробах муки, теста и хлеба определяли содержание СБГКП и разработанный нами показатель - разжижающую активность бактериальной альфа-амилазы,
Результаты анализа позволили разделить пробы муки на две группы:
* пораженные - пробы, в хлебе из которых КБХ была обнаружена через 36 ч хранения и ранее; эти пробы в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 оцениваются как пораженные картофельной болезнью и не допускаются для использования на хлебопекарные цели.
* кондиционные - пробы, в хлебе из которых КБХ была обнаружена после 36 ч хранения.
Усреднённые значения полученных данных по обеим группам проб приведены в таблице 1.
Таблица 1 – Средние значения показателей порчи хлеба в «кондиционных» и «пораженных» пробах производственной муки
Показатель
|
Мука
|
Тесто
|
Длительность хранения хлеба, ч
|
0
|
24
|
36
|
48
|
60
|
90
|
Пробы муки кондиционные
|
СБГКП, КОЕ/г·103
|
0,16
|
0,23
|
3,7
|
48
|
2150
|
4240
|
47330
|
–
|
РА, %
|
–
|
–
|
0
|
1,4
|
13,4
|
35
|
73
|
89
|
КБХ, балл
|
–
|
–
|
0
|
0
|
0
|
0,5
|
1
|
1,9
|
Пробы муки, пораженные КБХ
|
СБГКП, КОЕ/г·103
|
0,20
|
0,22
|
3,2
|
365
|
26400
|
118330
|
250000
|
–
|
РА, %
|
–
|
–
|
0
|
21
|
82
|
94
|
96
|
–
|
КБХ, балл
|
–
|
–
|
0
|
0
|
0,8
|
2,3
|
3,2
|
3,5
|
Из данных таблицы 1 видно, что исходное содержание СБГКП в муке и тесте было низким и группы проб не имели достоверных отличий. Различия между группами отсутствовали и в хлебе сразу после выпечки. Однако нами установлено, что в свежевыпеченном хлебе содержание СБГКП не только не снижалось по сравнению с тестом и мукой, но, наоборот, возрастало десятикратно.
Этот интересный факт можно объяснить термической активацией поврежденных и покоящихся спор, с одной стороны, и началом развития термоустойчивых форм СБГКП в условиях брожения и выпечки хлеба, с другой. Последовательность процессов, приводящих к порче хлеба при его хранении, в целом можно представить следующим образом:
- с первых часов хранения хлеба - быстро ускоряющийся рост СБГКП,
- после 16-22 ч хранения хлеба - индуцированный синтез альфа-амилазы споровыми бактериями, что подтверждается в работе Coleman G. [7];
- после 31-48 ч хранения - появление органолептических признаков КБХ в хлебе (специфический запах).
Следует отметить, что установленные нами закономерности были общими для пораженных и кондиционных проб, но отличались интенсивностью процессов (рисунок 1).
Рисунок 1 - Влияние продолжительности хранения хлеба на показатели порчи:
А – разжижающую активность бактериальной A-амилазы;
Б – картофельную болезнь хлеба;
В – спорообразующие бактерии группы картофельной болезни.
Как видно из рисунка 1, пораженные пробы характеризовались более мощным нарастанием РА: уже через 24 ч ее величина превышала 20%, а через 48 ч достигала возможного максимума (94%), свойственного полностью гидролизованному субстрату. В кондиционных пробах синтез A-амилазы протекал замедленно, начиная с 36 ч хранения хлеба, и даже через 90 ч величина РА не достигала возможного максимума.
Аналогичная картина наблюдалась и в динамике КБХ. В пораженных пробах болезнь с интенсивностью 0,5 балла была обнаружена в среднем через 31 ч, в кондиционных – через 48 ч. Разница в интенсивности КБХ через 60 ч составила 2,2 балла при оценке кондиционных проб 1 балл, а пораженных проб 3.2 балла (таблица 1).
Самым быстрорастущим оказался показатель СБГКП, отражающий первопричину порчи - процесс размножения возбудителей. Так, количество СБГКП в хлебе из пораженных проб муки через 36 ч хранения достигло 26400 КОЕ/г·103. В кондиционных пробах зараженность в этот период была в 10 раз ниже – 2150 КОЕ/г·103, и лишь через 60 ч хранения приблизилась к 50000 КОЕ/г·103.
При этом прослеживалась тесная взаимосвязь исследуемых показателей. Так, интенсивный синтез амилазы и резкое нарастание РА наблюдалось при содержании СБГКП свыше 1000 КОЕ/г·103. Значение РА в этот момент составляло около 12%. С помощью регрессионного анализа установлен вид связи между разжижающей активностью ?-амилазы и количеством споровых бактерий в хлебе в процессе его длительного хранения, до 60 ч. Эта связь является тесной (квадрат коэффициента корреляции R2 = 0,87) и имеет полиномиальный вид (рисунок 2).
Из приведенных экспериментальных данных следует, что кондиционная мука по сравнению с пораженной КБХ характеризуется замедленным нарастанием количества СБГКП и РА в хлебе, что в конечном счете приводит к более позднему и менее интенсивному проявлению картофельной болезни.
Для наглядного сопоставления процессов порчи в хлебе из пораженной и кондиционной муки рассчитаны соотношения между двумя группами проб по показателям порчи в период хранения хлеба (таблица 2).

Рисунок 2 - Зависимость величины РА в хлебе от поражения его споровыми бактериями (СБГКП), в течение 60 часов хранения.
Таблица 2 – Соотношение показателей порчи хлеба между пораженными и кондиционными пробами муки (разы)
Показатели порчи
|
Хранение хлеба, часы
|
24
|
36
|
48
|
60
|
90
|
СБГКП, КОЕ/г·103
|
7,6
|
12,3
|
27,8
|
44,4
|
–
|
РА, %
|
17,5
|
6,6
|
2,7
|
1,3
|
–
|
КБХ, баллы
|
–
|
–
|
4,6
|
3,2
|
1,9
|
Данные, приведенные в таблице 2, дают представление о динамике и интенсивности процессов порчи в двух группах проб. В хлебе из проб пораженной муки до конца инкубирования СБГКП сохраняют более высокую скорость размножения, разница в которой нарастает по мере хранения (с 7,6 до 44,4 раза). Особенностью хлеба из проб пораженной муки является ранний интенсивный синтез ?-амилазы. При этом по величине РА при хранении в течение 24-х и 36-и ч он обгоняет хлеб из проб кондиционной муки в 17,5 и 6,6 раза соответственно, что и приводит к более интенсивному развитию КБХ (через 48 ч – в 4,6 раза).
Различия между хлебом из кондиционной и пораженной муки особенно заметны на начальном этапе развития КБХ, оцениваемой 0,5 баллами (таблица 3). Пораженные пробы превышают кондиционные по содержанию СБГКП в 3,7 раза, по РА – в 1,6 раза. При этом время проявления первых признаков КБХ сокращается в 1,5 раза. По мере нарастания интенсивности КБХ до 1 балла значения показателей порчи в обеих группах выравниваются (0,9; 1,1); соотношение времени возникновения КБХ в пораженных и кондиционных пробах остается прежним (в 1,6 раза быстрее).
Таблица 3 – Сопоставление показателей порчи в кондиционных и пораженных пробах при разной интенсивности «картофельной» болезни хлеба (КБХ)
КБХ, баллы
|
Показатели
порчи
|
Пробы
|
Отношение показателей порчи
|
кондиционные
|
пораженные
|
|
СБГКП, КОЕ/г·103
|
4240
|
15600
|
3,7
|
0,5
|
РА, %
|
35
|
57
|
1,6
|
|
КБХ, ч
|
48
|
31
|
1,5
|
|
СБГКП, КОЕ/г·103
|
47300
|
41700
|
0,9
|
1,0
|
РА, %
|
73
|
84
|
1,1
|
|
КБХ, ч
|
60
|
38
|
1,6
|
Несмотря на то, что популяция споровых бактерий в хлебе из проб кондиционной муки характеризуется замедленным ростом, удельная вредоносность, рассчитанная на определенное количество бактерий, оказалась в ней на конечных этапах порчи выше, чем в хлебе из проб пораженной муки (таблица 4, рисунок 3).
Так, через 48 ч хранения в хлебе из пораженных проб муки споровые бактерии имели 0,8% РА, тогда как в кондиционных пробах – 8,2% РА в расчете на КОЕ/г·106.
Таблица 4 – Удельная активность популяций СБГКП в пораженных и кондиционных пробах
Показатель
|
Группа проб
|
Продолжительность хранения хлеба, ч
|
0
|
24
|
36
|
48
|
60
|
РА, %/СБГКП*
|
пораженные
|
0
|
57,5
|
3,1
|
0,80
|
0,38
|
кондиционные
|
0
|
29,2
|
6,2
|
8,2
|
1,5
|
КБХ, балл/СБГКП**
|
пораженные
|
0
|
0
|
30,3
|
19,5
|
5,4
|
кондиционные
|
0
|
0
|
0
|
120
|
20
|
Аналогичная картина наблюдалась и с КБХ: интенсивность заболевания хлеба в баллах, отнесенная к показателю СБГКП (КОЕ/г·109), в пораженных пробах была существенно ниже на последних сроках хранения, чем в кондиционных. Таким образом, можно сделать вывод о наличии различных популяций спорообразующих бактерий группы картофельной палочки, которые обладают разной физиологической активностью, что и приводит к некоторому выравниванию процесса порчи хлеба при длительном его хранении: в пораженных и кондиционных пробах сокращаются различия по разжижающей активности ?-амилазы и интенсивности КБХ. Полученные данные - наглядный пример как бы «быстроиграющей» и «долгоиграющей» популяции спорообразующих бактерий.

Рис. 3. Отношение разжижающей активности (А) и органолептических показателей (Б) к количеству спорообразующих бактерий в пораженных и кондиционных пробах.
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что на интенсивность процессов порчи хлеба влияет не только скорость роста СБГКП в хлебе, но и физиологическая активность популяции споровых бактерий, загрязняющих хлеб. Вследствие того, что разжижающая активность спорообразующих бактерий группы картофельной палочки характеризует степень «агрессивности», т.е. способность вызывать КБХ, всей популяции СБГКП, присутствующей на зерне или сохранившейся в хлебе после выпечки, то этот показатель является интегральным. Методы разработанные во ВНИИЗ по выявлению КБХ в зерне и хлебе, в основе которых лежит определение разжижающей активности СБГКП, учитывают при определении и физиологическую активность спорообразующих бактерий, и их количество на момент определения, в то время как количество СБГКП, определенное микробиологическим методом, является менее информативным показателем ввиду ошибки определения и большой неоднородности популяции по вредоносности отдельных изолятов.
Известно, что длительно и неправильно хранящийся хлеб в десятки и сотни раз превышает самосогревающееся зерно, зерновую пыль или отходы по содержанию споровых бактерий [8]. Поэтому очень важно, что временной интервал между появлением первых органолептических признаков КБХ и началом гидролиза крахмала в хлебе, обнаруженного с помощью вискозиметрического метода, составил в пораженных пробах около 13 ч. Следовательно, разработанные вискозиметрические методы позволяют заблаговременно достоверно выявлять в хлебе ранние стадии порчи КБХ, не допуская высоких уровней обсеменения споровыми бактериями, достигающих несколько миллионов спор в 1 г хлеба.
Список литературы
1. Инструкция по предупреждению картофельной болезни хлеба на хлебопекарных предприятиях: ГНУ ГосНИИХП. – М.: 2012. – 32с.
2. Мелешкина Е. П. Связь числа падения со свойствами углеводно-амилазного комплекса муки // Хлебопродукты. – 2005. - № 9. – С. 28 - 32.
3. Мартьянова А. И., Пищугина Е. П., Царькова Н. М. О разработке нового показателя оценки качества муки на отечественном приборе ПЧП-3 // Союз.-2001. - № 3. - С. 15 - 16.
4. Демчук А.П., Ройтер И.М. Методы выявления и предупреждения «картофельной» болезни хлеба. – М.: ЦНИИТЭИ Пищепром, 1970. – 41 с.
5. Львова Л.С. Вискозиметрический метод определения зараженности зерна возбудителями «картофельной болезни» хлеба / Л.С. Львова, А.В. Яицких // Хлебопродукты. – 2014. – №2. – С. 55-57.
6. Львова Л.С. Вискозиметрический метод определения «картофельной болезни» в муке и хлебе / Л.С. Львова, А.В. Яицких // Хлебопродукты. – 2013. – №12. – С. 52-55.
7. Coleman G., Elliot W.H. Studies on ?-amylase formation by Bacillus subtilis // Biochem. J. – 1962. – V.83. – P.256.
8. Львова Л.С. Источники загрязнения зерна спорообразующими бактериями – возбудителями «картофельной» болезни хлеба / Л.С. Львова, А.В. Яицких // Хлебопродукты. – 2013. – №9. – С. 57-59.
Д.т.н. Е.П. Мелешкина, научный сотрудник А.В. Яицких
Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Зерна и продуктов его переработки
Статья опубликована в журнале:
Хлебопечение России. – 2015. - №4. – С.12-15